Preparação de amostras e imagem de bactérias marcadas com fluorescência

Resumo

Fonte: Chetrit, D., et al. Aplicação de imagens de células vivas e tomografia crioeletrônica para resolver características espaçotemporais do sistema de secreção Dot/ICM da Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra a preparação e a imagem de bactérias patogênicas marcadas com fluorescência. As almofadas de agarose são primeiro preparadas e posicionadas dentro de uma moldura adesiva. Uma suspensão de bactérias geneticamente modificadas que expressam uma proteína fluorescente é aplicada à almofada para imobilizar as células. A moldura é então selada com uma capa de cobertura e observada ao microscópio para capturar imagens de fluorescência das bactérias.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos envolvendo o crescimento, manipulação e imagem de L. pneumophila devem ser realizados em laboratório de segurança biológica nível 2, em conformidade com as diretrizes locais.

1. Inserção de sfGFP no cromossomo Legionella pneumophila usando estratégia de troca alélica e dupla seleção (Figura 1, Figura 2)

1. Clone no vetor de substituição gênica pSR47S11 a seguinte sequência: a sequência a 1.000 pbp acima do local de interesse, depois a sequência sfGFP, e depois a 1.000 pbp a jusante do sítio de interesse (Figura 1). A sequência sfGFP deve ser colocada em frame para as extremidades N-terminales ou C-terminales com um linker que contenha de quatro a oito aminoácidos. Transforme o vetor resultante em Escherichia coli DH5αλpir. Depois, faça estiramento de L. pneumophila (o receptor) para colônias individuais em ágar de extrato de carvão e levedura (CYE) contendo 100 μg/mL de estreptomicina e cultive por 5 dias a 37 °C (Figura 2).
2. Faça uma estria de L. pneumophila em CYE-agar-estreptomicina e cresça por 2 dias a 37 °C (zona pesada). Streak E. coli DH5α transformado com plasmídeo auxiliar pRK600 (ajudante) em ágar LB contendo 25 μg/mL cloranfenicol. Estire a E. coli DH5αλpir (doador) em ágar LB contendo 50 μg/mL de kanamicina.
3. Realize acasalamento triparental: incube uma colônia do ajudante, uma colônia do doador e do receptor sobrepondo áreas das três cepas em uma placa de ágar CYE sem seleção e incubando por 4–8 horas a 37 °C. Como controles negativos, incube uma mistura de cepa ajudante+receptor e uma mistura de cepa doadora+receptora pelos mesmos períodos de tempo.
4. Resuspenda as reações de acasalamento em 500 μL de_{ddH 2}O. Placa 20 μL e 50 μL das reações em ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e 10 μg/mL de kanamicina e cultive por 5 dias a 37 °C. Faça uma sequência de quatro dos clones resultantes em ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e cultive por 5 dias a 37 °C.
5. Faça 16 clones em ágar CYE contendo 5% de sacarose e 100 μg/mL de estreptomicina e cresça por 5 dias a 37 °C. Depois, estirar 32 desses clones em ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e em ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e 10 μg/mL de kanamicina e cultivar por 5 dias a 37 °C.

2. Isolamento de Clones que Integraram a sfGFP no cromossomo L. pneumophila

1. Clones de strias sensíveis à canamicina em placas CYE-agar-estreptomicina confirmam a inserção de sfGFP no cromossomo por meio da reação em cadeia da polimerase de colônia (PCR). Use primers complementares ao gene sfGFP e à região cromossômica de interesse para amplificar a junção de inserção.
   1. Misture 0,5 μL de cada uma das soluções de primer de 10 μM e uma colônia até um volume final de 12,5 μL e desnature por 10 minutos a 95 °C. Resfrie no gelo por 10 minutos, adicione 12,5 μL de 2x solução de mistura mestra PCR e realize uma análise por PCR.
2. Cultive manchas densas das colônias isoladas em placas CYE-agar-estreptomicina por 2 dias a 37 °C. Examine os níveis de expressão e a estabilidade das fusões de sfGFP por imunoblotting com um anticorpo anti-GFP.

3. Imagem de Células Vivas de L. pneumophila com componentes Dot/Icm Marcados com Fluorescência

1. Preparação de almofadas de agarose
   1. Faça cerca de 30 mL de uma solução de agarose de baixa fusão a 1% em água. Aqueça no micro-ondas em um frasco de vidro por cerca de 90 segundos, girando ocasionalmente, até que a agarose esteja completamente dissolvida.
   2. Coloque dois slides de^vidro 3 de 22 x 22 x 22 x 0,15 mm na borda de um slide de^vidro 3 de 25 x 75 x 1,1 mm, um sobre o outro. Empilhe mais dois slides de vidro de 22 x 22 x 0,15 mm³ na outra borda.
   3. Pipete cerca de 1 mL da agarose fundida na lâmina central entre as duas lâminas superiores de vidro, depois coloque^{outra lâmina} de 25 x 75 x 1,1 mm 3 sobre a agarose derretida. Tente evitar a formação de bolhas de ar. Resfrie os slides a 4 °C por 15 minutos.
   4. Usando um bisturi ou lâmina de barbear, corte delicadamente a almofada em pequenos quadrados, ~5 x 5^{mm 2}. Fixe uma estrutura adesiva dupla face de 17 x 28 x 0,25 mm³ em um ferrolho^{de vidro} 3 de 25 x 75 x 1,1 mm e coloque várias almofadas no ferrolho.
2. Aquisição de imagem
   NOTA: Os passos a seguir são descritos para um microscópio sob o controle do SlideBook 6.0 e equipado com iluminadores de estado sólido, câmera monocromática CCD e uma lente objetiva de 100x (abertura numérica 1,4). Se necessário, utilize dispositivos de microscopia alternativos com configurações de hardware e software apropriadas que possam ser personalizadas de acordo com as configurações do protocolo.
   1. Dissolva uma mancha pesada de L. pneumophila em 1 mL de_{ddH 2}O, vórtice e pipete 2–3 μL da diluição nas almofadas. Coloque suavemente um coverslip de⁵⁰ x 24 x 0,15 mm 3 sobre a estrutura adesiva.
   2. Na janela de captura, ajuste o ND para 180. Ajuste o binning para 2×2 e use o canal de 488 nm para expor a amostra entre 500–1.000 ms. Valide a especificidade do sinal de fluorescência por meio de imagens de L. pneumophila não marcada com os mesmos parâmetros (Figura 3).

Resultados

Figura 1: Visão geral esquemática da recombinação homóloga e da troca alélica usada para inserir sfGFP no cromossomo L. pneumophila.(A) Foi realizado um acasalamento triparental entre uma cepa auxiliar d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Objetivo 100x do Plan Apo (1.4 NA)	Nikon
ASES	Sigma-Aldrich	A9758
Carvão ativado	Sigma-Aldrich	C5510
Agarose GPG/LMP, baixa fusão	Bioanálise americana	AB00981
Ágar bacto desidratado	BD	214010
Quadro Genético, 1,7x2,8 cm, 125 μL	Fisher Scientific	AB-0578
L-Cisteína	Sigma-Aldrich	C7352
Portas de cobertura de microscópio 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Portas de cobertura do microscópio 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545K
Laminas de microscópio 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Inovações em Imagem Inteligente
Motor leve Spectra X	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific
Extrato de Levedura	BD	212750