Estabelecendo um modelo camundongo para infecção por Clostridium difficile

Resumo

Fonte: Winston, J. A., et al. Modelo de camundongo tratado com cefoperazona da cepa clinicamente relevante de Clostridium difficile R20291. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o procedimento para inocular camundongos pré-tratados com antibióticos com esporos de Clostridium difficile para estabelecer um modelo murino de infecção para estudar patogênese e respostas do hospedeiro.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Preparação do Inóculo de Esporos de Clostridium difficile e o Gavage Oral dos Ratos

NOTA: Camundongos enfrentados com esporos de C. difficile devem ser alojados em uma instalação animal de Biossegurança Nível 2.

1. Obtenha um estoque de esporos de C. difficile da cepa desejada (neste caso, R20291) que tenha sido preparado e armazenado a 4 °C em água estéril. Determine a enumeração desse estoque de esporos antes do uso.
2. Com base na concentração conhecida (esporos/ml) do estoque de esporos, calcule a diluição desejada para obter 10⁵ esporos por 25 μl. Garantir que o volume do inóculo seja adequado para inocular todos os camundongos do experimento (25 μl por camundongo), realizar a enumeração do inóculo (aproximadamente 30 μl) e contabilizar o erro de pipeteamento.
3. Vortex o estoque original de esporos de C. difficile . Em seguida, resuspenda o volume calculado (a partir da etapa 1.2) do estoque original de esporos de C. difficile em água estéril dentro de um tubo de microcentrífuga com tampa roscada. Realize isso aeróbicamente em um capuz de fluxo laminar. Identifique essa mistura diluída como o "inoculo de esporos".
4. Coloque o inóculo de esporos em um banho-maria a 65 °C e aqueça por 20 minutos.
   NOTA: Essa etapa garantirá que apenas esporos ativos de C. difficile permaneçam após o tratamento térmico.
5. Dentro da capela de fluxo laminar, pegue 50 μl de inoculo de esporos aquecidos, coloque-o em um tubo estéril de microcentrífuga e passe para a câmara anaeróbia. Use esta amostra para enumeração de esporos.
6. Dentro do capuz de fluxo laminar, coloque o inóculo de esporos aquecido restante em uma seringa de 1ml presa a uma agulha gástrica estéril com ponta de bulbo. Utilize um passo de som manual para garantir uma dosagem rápida e precisa entre os camundongos. Certifique-se de que a agulha do gavage esteja cheia com o inoculo de esporos aquecido antes do uso.
   NOTA: Não é necessário um novo agulha de gavage estéril para cada camundongo. No entanto, se várias doses de esporos de C. difficile forem administradas, uma nova agulha de gavage é recomendada para cada dose.
   NOTA: Os esporos de C. difficile são altamente resistentes aos desinfetantes tradicionais. Portanto, o uso de um desinfetante esporicida, como o Desinfetante Esporicida #62 Perisept, é necessário. O fabricante recomenda um tempo de contato de 2 minutos para destruir os esporos de C. difficile .
7. Coloque cada camundongo com 25 μl do inoculo de esporos. Imobilize cada camundongo suavemente, segurando o animal pela pele frouxa do pescoço e das costas para imobilizar a cabeça. Usar o dedo indicador imobiliza ainda mais a cabeça do animal e alonga o esôfago. Certifique-se de que o animal não vocalize ou demonstre outros sinais de sofrimento durante a contenção.
   NOTA: O volume total dado aos camundongos pelo gavage não deve exceder 10 ml/kg de peso corporal (0,1 ml/10 g).
8. Mantenha o rato em posição vertical e ereto e passe suavemente a agulha gavage para a lateral da boca. Direcione a agulha de gavage ao longo do céu da boca e avance lentamente a agulha de gavage para dentro do esôfago.
   NOTA: Se houver resistência, a agulha gavage pode estar entrando na traqueia e, portanto, NÃO deve ser avançada, mas sim removida e reposicionada imediatamente.
9. Depois que a agulha do esôfago estiver aproximadamente na metade do esôfago, injete 25 μl do inoculo do esporos aquecido e retire suavemente a agulha do esôfago.
   NOTA: O avanço forçado da agulha do gavage pode levar à ruptura do esôfago ou do estômago. Portanto, se houver resistência ao avançar a agulha do gavage, é melhor remover e reposicionar imediatamente a agulha.
10. Volte o animal para sua gaiola e observe se há tosse ou sinais de dificuldade respiratória, pois isso pode indicar administração traqueal inadvertida ou aspiração do inóculo aquecido do esporos.
    NOTA: Os camundongos são extremamente suscetíveis a C. difficile após tratamento antibiótico; Portanto, precauções para evitar contaminação cruzada entre gaiolas são essenciais. Isso é especialmente importante ao lidar com camundongos tratados com antibióticos, mas não contestados, como controles.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Limpador de Desinfetante Esporicial do Perisepto #62	SSS Navigator	48027	Este produto exigirá diluição conforme recomendado pelo fabricante
Mouses C57BL/6J	O Laboratório Jackson	664	Os ratos devem ter entre 5 e 8 semanas de idade
Tampa de rosca micro centrífuga de 2 ml	Corning	430917