$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.
- Obtenção de Amostras para Enumeração por Clostridium difficile (C. difficile)
NOTA: Antes de obter fezes ou teor cecal, pese tubos estéreis de microcentrífuga em uma balança analítica. Registre o peso do tubo na lateral do tubo, arredondando para quatro casas decimais (por exemplo, 0,9864 g). Denote esse peso como o "peso do tubo". Cada amostra coletada deve ser colocada em um tubo de microcentrífuga estéril e pesado.
1. Coleção estéril de fezes de camundongo- Segure suavemente cada rato segurando o animal pela pele frouxa do pescoço e das costas para imobilizar a cabeça. Use o dedo mindinho para prender suavemente a cauda do animal, expondo assim o ânus. Certifique-se de que o animal não vocalize ou demonstre outros sinais de sofrimento durante a contenção.
- Segure um tubo de microcentrífuga estéril e pesado diretamente sob o ânus do animal. É fundamental que o tubo não entre em contato direto com o mouse.
- Enquanto o animal defeca, colete a pastilha fecal no tubo. Mantenha o tubo em temperatura ambiente até que todas as amostras fecais sejam coletadas. Pode levar vários minutos para um camundongo defecar, o que exige tentativas repetidas de coletar fezes.
- Pese os tubos contendo fezes na balança analítica. Registre o peso do tubo, arredondando para quatro casas decimais (por exemplo, 1,0021 g). Denote o peso obtido como o "peso final do tubo".
- Passe as amostras fecais para a câmara anaeróbica para enumeração bacteriana logo após a coleta das fezes.
- Enumeração bacteriana de C. difficile
- Calcule o peso final do conteúdo (fezes) que será enumerado para C. difficile. Fez isso subtraindo o "peso final do tubo" do "peso do tubo".
- Calcule uma diluição de 1:10 do conteúdo em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1X e resuspenda de acordo. Para pellets fecais, use a ponta da pipeta para desfazer suavemente a pellet em solução.
- Incube anaeróbicamente essas amostras ressuspensas em temperatura ambiente por 30 minutos, permitindo que o conteúdo se assente.
- Faça diluições seriadas para cada amostra em 1x PBS para enumeração das unidades formadoras de colônia (UFC) por g de conteúdo (fezes). Faça isso de forma anaeróbia.
- Utilizando a técnica asséptica, transfira 100 μl de cada diluição serial para placas de ágar de frutose de cicloserina cefoxitina (TCCFA) taurocolato. Usando um espalhador estéril em formato de L, espalhe a diluição aplicada no meio para distribuí-la uniformemente pela placa. A dispersão uniforme da diluição é essencial para a enumeração precisa das colônias.
- Incube as placas anaeróbicamente por 24 horas a 37 °C. Neste momento, enumere as colônias de C. difficile para obter a CFU por g de conteúdo (fezes). As colônias de C. difficile são planas e amarelo-pálido, apresentam bordas irregulares e aparência de vidro espoliado.
NOTA: Esse protocolo pode ser usado para enumerar C. difficile de outros conteúdos gastrointestinales (GI) murinos, incluindo conteúdo ileal e cólon. Placas de reação em cadeia da polimerase (PCR) podem ser usadas para fazer diluições em série.