Ensaio baseado em fluorescência para investigar interações entre receptores de macrófagos e antígenos bacterianos

Resumo

Fonte: Barbero, A. M., et.al. Ensaios de fluorescência para o estudo da interação entre Mycobacterium tuberculosis e o receptor imunológico SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em fluorescência para estudar a interação entre um receptor de macrófagos e antígenos do Mycobacterium tuberculosis . Antígenos marcados fluorescentemente em um coverslip são incubados com extratos de proteína de macrófagos, reticulados, marcados por anticorpos e visualizados por sinais de fluorescência sobrepostos.

Protocolo

1. Interação entre Mycobacterium tuberculosis e SLAMF1 por microscopia de fluorescência

1. Reticulação bactéria-proteína
   1. Introduza coberturas redondas de 12 mm em placas de cultura de 24 poços (1 cobertura por poço) usando pinças cirúrgicas de nariz redondo.
      NOTA: Limpe bem as coberturas com 70% de etanol. Se desejado, podem ser autoclavados ou esterilizados sob luz UV por 30 minutos.
   2. Incube o cobertor com 400 μL de 10 μg/mL de Poli-D-Lisina durante a noite a 4 °C. Cubra a placa com papel alumínio para protegê-la da luz.
   3. No dia seguinte, retire o prato da geladeira e lave a capa duas vezes com 1 mL de água.
   4. Deixe a capa secar.
   5. Dilua 20 μL (2 x 10⁶) de Mtb-R Ags em 180 μL de 1x PBS. Os últimos 200 μL são suficientes para cobrir completamente um deslizamento de cobertura.
   6. Incube o coverslip com Mtb-R Ags por 1 hora a 37 °C em uma incubadora celular.
   7. Descarte o líquido restante e lave duas vezes com 1mL de 1x PBS (soro salino tamponado com fosfato).
      NOTA: Nessa etapa, a adesão correta do Mtb-R ao coverslip pode ser verificada com um microscópio de fluorescência usando os filtros correspondentes ao canal vermelho.
   8. Adicione 400 μL de tampão bloqueante (10% soro fetal bovino (FBS) em 1x soro salino tamponado com fosfato (PBS) por 30 minutos em agitação (shaker).
   9. Lave duas vezes com 400 μL de buffer bloqueante.
   10. Incubar com 100 μL de extrato proteico diluído em 300 μL de 1x PBS por 2 horas em RT em agitação (shaker).
   11. Adicione 400 μL de formaldeído a 1% diluído em 1x PBS. Incubar por 15 minutos sob agitação (shaker) no RT.
   12. Adicione 500 μL de glicina 0,125 M diluída em água. Incube por 5 minutos sob agitação (shaker) no RT.
   13. Lave duas vezes com 1 mL de 1x PBS.
   14. Adicione 400 μL de 2 mM de bis(succinimidilsuccinato) de etilenoglicol (EGS) por 1 hora em RT em agitação (shaker).
   15. Repita o passo 1.1.13
       NOTA: A preparação dos reagentes no momento do uso é altamente recomendada.
2. Coloração SLAMF1
   1. Envolva a tampa da placa de cultura em filme de parafina.
   2. Adicione uma gota de 60 μL do anticorpo primário anti-SLAMF1 previamente titulado (diluição 1:75) na tampa coberta por filme de parafina.
   3. Remova cuidadosamente a cobertura da placa usando pinças cirúrgicas curvas de ponta fina e agulhas.
      NOTA: Para facilitar a remoção do coverslip, a agulha pode ser dobrada em um ângulo aproximado de 45°.
   4. Inverta o coverslip sobre a gota contendo o anticorpo. Incubar por 30 minutos no RT no escuro.
   5. Levante a capa e lave duas vezes com o buffer de bloqueio.
   6. Inverta o slip sobre uma nova gota contendo o anticorpo secundário (diluição 1:200). Incubar por 30 minutos no RT no escuro.
   7. Repita o passo 1.2.5.
   8. Remova o excesso de líquido e monte a cobertura sobre uma gota de líquido de montagem colocada em uma lâmina de vidro.
   9. Observe sob o microscópio de fluorescência usando filtros adequados.
      NOTA: É recomendado trabalhar em condições estéreis. Dilua os anticorpos no buffer de bloqueio. Manuseie a capa com cuidado para evitar riscos que possam dificultar a observação ao microscópio. Um fluido de montagem adequado para fluorescência é altamente recomendado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo secundário Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21121	Para microscopia de fluorescência
Anticorpo primário anti-SLAMF1	BioLegend	306302	Para microscopia de fluorescência
Aqua-Poly/Mount	Policiências	18606-20	Mídia de montagem
Coberturas 12mm	HDA	-	Para ensaio de interação por microscopia
EGS	ThermoFisher Scientific	21565	Para tratamento de reticulação
Formaldeído	Merck	K47740803613	Para tratamento de reticulação
Slides de vidro	Glass Klass	-	Para ensaio de interação por microscopia
Glicina	Sigma	G8898	Para tratamento de reticulação
Imager.A2	Carl Zeiss	430005-9901-000	Microscópio de fluorescência com módulo de iluminação Colibri 7
Poli-D-Lisina	Sigma Aldrich	A-003-M	Para tratamento de coverslips
Rodamina B	Sigma Aldrich	21955	Para M. Coloração por tuberculose