Desenvolvimento de um modelo de infecção larval de peixe-zebra usando microgavage

Resumo

Fonte: Li, J., et al. Desenvolvimento de um modelo larval de infecção por peixe-zebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra o procedimento de microgavage, no qual uma larva de peixe-zebra anestesiada é imobilizada em agarose e injetada oralmente com uma bactéria patogênica usando uma agulha guiada por traçadores. O parto não invasivo imita infecção natural, permitindo a análise da replicação bacteriana, liberação de toxinas e danos epiteliais intestinais.

Protocolo

1. Gavage de larvas de peixe-zebra

1. Calibre a agulha microgavage.
2. Meça o diâmetro da ponta da agulha colocando a agulha sobre uma lâmina de calibração com uma gota de óleo mineral. Certifique-se de que a ponta tenha 30–40 μm de diâmetro, seja cega e lisa. Descarte as agulhas afiadas ou ásperas.
   NOTA: As bordas afiadas das agulhas podem ser embotadas por chamas rápidas.
3. Prepare a solução de gavage.
4. Carregue e monte a agulha em um micromanipulador.
5. Ajuste o micromanipulador para posicionar a agulha em um ângulo de 45°.
6. Anestesiar as larvas do peixe-zebra. Quando as larvas pararem de se mover, transfira-as para o sulco de um molde microgavage usando uma pipeta Pasteur.
7. Coloque uma gota de 0,8% de agarose de baixa fusão sobre as larvas de peixe-zebra para cobrir. Ajuste suavemente as larvas com as cabeças voltadas para cima em ângulos de 45° no sulco e as caudas contra a parede do sulco. Certifique-se de que os ângulos das cabeças estejam aproximadamente iguais para que fiquem alinhados com o ângulo das agulhas de gavage. Coloque o mofo microgavage sobre o gelo por 30–60 s, permitindo que a agarose de baixa degelo solidifique, a fim de estabilizar as posições das larvas.
8. Ajuste a pressão de injeção entre 200–300 hPa. Ajuste o tempo de injeção para 0,1–0,3 s para obter um volume de injeção de 3–5 nL de Clostridioides difficile.
9. Opere suavemente a agulha através da agarose, depois para a boca das larvas do peixe-zebra, passando pelo esôfago. Uma vez que a ponta da agulha esteja dentro do bulbo anterior do intestino, pressione o pedal da injeção para liberar as bactérias. Preencha o lúmen do intestino com o volume entregue. Não deixe transbordar do esôfago ou da cloaca. Retirar suavemente a agulha da boca do peixe-zebra.
10. Após o gavage, resgate as larvas infectadas do peixe-zebra da agarose com uma ponta flexível de microcarga, primeiro cortando a agarose e depois levantando as larvas. Transfira essas larvas para um meio de Danieau estéril com 30% de gordura. Enxágue as larvas em meio estéril duas vezes. Transfira as larvas para uma nova placa de Petri de 10 cm. As larvas serão mantidas por até 11 dias após a fertilização (dpf).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Agarose de gelificação ultra-baixa
Fusão baixa da agarose (LM)	Pronadisa	8050	É usado em placas de agarose
Vidro Capilar	Aparato de Harvard	30-0019	Agulhas de injeção
Clostridioides difficile			R20291, uma cepa ribotipo 027, produção TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	Plataforma de código aberto		Processamento de imagem
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Puxador de agulha horizontal	Sutter instrument Inc	P-87
L-cisteína	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Processamento de imagem
Micro injetor	eppendorf	5253000017
Moldes de microinjeção	Ferramentas de Ciência Adaptativa	TU1
Microscópio confocal Leica SP8	Leica
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290
Cloreto de potássio (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Cloreto de sódio (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocolado	Carl Roth GmbH	8149
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Extrato de levedura	BD Bacto	212750