Inoculação de um patógeno bacteriano nas folhas de Arabidopsis por infiltração a vácuo

Resumo

Fonte: Rufián, J. S., et.al. Análise de célula única da expressão dos genes de Pseudomonas syringae no tecido vegetal. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra um método de infiltração a vácuo para introduzir um patógeno bacteriano nas folhas das plantas de Arabidopsis . A abordagem utiliza uma suspensão bacteriana preparada e pulsos de vácuo para permitir uma entrada uniforme através dos estomas, resultando em infecção controlada nas folhas.

Protocolo

1. Inoculação de plantas de Arabidopsis

NOTA: Neste estudo, as cepas Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 e P. syringae PV. Foram usadas phaseolicola 1448A.

1. Prepare o inoculum de P. syringae.
   1. Retire a cepa de P. syringae de interesse de um estoque de glicerol de −80 °C em uma placa LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de NaCl, 5 g/L de extrato de levedura e 16 g/L de ágar bacteriológico) suplementada com os antibióticos apropriados. Incube a 28 °C por 40-48 horas.
      NOTA: O uso de antibióticos é recomendado se a cepa de interesse possuir um plasmídeo ou um gene de resistência genômica. As concentrações recomendadas de antibióticos para P. syringae são as seguintes: kanamicina (15 μg/mL), gentamicina (10 μg/mL), ampicilina (300 μg/mL).
   2. Raspe a biomassa bacteriana e resuspenda em 5 mL de 10 mM de_{MgCl 2}. Meça o OD₆₀₀ e ajuste para 0,1 adicionando 10 mM de MgCl₂.
      NOTA: Um OD₆₀₀ de 0,1 de uma cultura de P. syringae corresponde a 5 x 10⁷ CFU·mL⁻¹.
   3. Realize diluições seriadas em 10 mM de_MgCl2 para alcançar uma concentração final do inoculo de 5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹. Prepare 200 mL de inoculo para as plantas de Arabidopsis .
   4. Logo antes da inoculação, adicione o surfactante Silwett L-77 a uma concentração final de 0,01% para Arabidopsis. Note que Silwett é um tanto prejudicial ao tecido de Arabidopsis .
2. Realize infiltração a vácuo.
   1. Para infiltração por Arabidopsis, coloque dois bastões de madeira formando um X sobre o vaso (Figura 1E) e coloque o vaso voltado para baixo sobre uma placa de Petri de 14 cm de diâmetro contendo o inoculo de 200 mL (Figura 1F).
   2. Insira as plantas imersas na solução do inoculo em uma câmara de vácuo (Figura 1G) e dê um pulso de 500 mbar por 30 s para infiltrar as folhas. Repita o pulso de vácuo 2-3 vezes até que a folha esteja completamente infiltrada (Figura 1H).
   3. Drene o excesso de solução de inoculo com uma folha de papel e retorne as plantas à câmara de crescimento correspondente.

Resultados

Figura 1: Inoculação bacteriana e extração de apoplasto usando plantas de Arabidopsis . (A) Preparação do vaso com a malha metálica devidamente fixada. (B) Semear sementes usando um palito para dist...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri de 140 mm			Sem requisitos especiais
Ágar bacteriológico	Roko
Sulfato de gentamicina	Duchefa	G-0124
Monosulfato de canamicina	Fitotecnologia	K378
MgCl₂	Merk
NaCl	Merk
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Triptona	Merk
Câmara de vácuo de 25 cm de diâmetro	Kartell	554
Bomba de vácuo	GAST	DOA-P504-BN
Extrato de Levedura	Merk
Ampicilina sódica	GoldBio