Imagem de Alta Capacidade de Infecção Intracelular por Brucella abortus em Células Epiteliais do Hospedeiro

Resumo

Fonte: Casanova, A., et al. Ensaios baseados em microscopia para triagem de alta produtividade de fatores do hospedeiro envolvidos na infecção por Brucella em células hela. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra imagens de alta taxa da infecção por Brucella abortus em células epiteliais com knockdown STING mediado por siRNA para investigar o papel da detecção do DNA citosólico na replicação intracelular bacteriana e na resposta imune inata do hospedeiro.

Protocolo

1. Infecção e Fixação

1. Um dia antes da infecção, inocule a quantidade determinada de cultura inicial de B. abortus em meio de 50 ml TSB/Km (Caldo de Soja Tríptico contendo 50 μg/ml de kanamicina) em um frasco de tampa roscada de 250 ml. Fele o frasco com Parafilm e cultive bactérias durante a noite a 37 °C e 100 rpm em um agitador orbital até OD₆₀₀ = 0,8-1,1.
2. Meça o OD₆₀₀ da cultura bacteriana e prepare o meio de infecção diluindo a cultura bacteriana em DMEM (Médio Eagle Modificado de Dulbecco) / 10% FCS (soro fetal para bezerro) para alcançar a multiplicidade desejada de infecção (MOI).
   NOTA: Para obter uma taxa de infecção de 5-10% nas células HeLa, é utilizado um MOI de 10.000. Uma curva de titulação do MOI deve ser realizada para cada tipo celular a fim de obter taxas ótimas de infecção.
3. Troque o meio de transfecção da placa de 384 poços por 50 μl do meio de infecção usando uma lavadora automática de placas.
4. Centrifuge a placa de 384 poços a 400 x g e 4 °C por 20 minutos.
   NOTA: Isso ajuda a sincronizar o processo de infecção.
5. Sele a placa com Parafilm e incube-a em uma placa de alumínio pré-aquecida em uma incubadora úmida de 37 °C com 5% de_CO2 por 4 horas.
6. Lave as células com DMEM/10% de FCS contendo 100 μg/ml de Gm (gentamicina) para inativar bactérias extracelulares usando a lavadora automática de placas (use 200 μl/lavagem de transbordamento de poço).
   NOTA: Durante uma lavagem de transbordamento, a lavadora automática de placas dispensa e aspira o meio simultaneamente.
7. Para o ensaio de entrada, lave as células uma segunda vez com DMEM/10% FCS contendo 100 μg/ml Gm e 100 ng/ml de aTc usando a lavadora automática de placas (use 200 μl/lavagem de transbordamento de poço).
8. Selar a placa com Parafilm e retorná-la a uma placa de alumínio pré-aquecida na incubadora úmida de 37 °C com 5% de_CO2 por mais 40 horas ou 4 horas, respectivamente, para o ensaio final e o ensaio de entrada.
9. Para fixação, lave os poços com PBS (soro tampado com fosfato) usando a lavadora automática de placas (use lavagem de 200 μl/poço de transbordamento).
10. Troque PBS com 50 μl de paraformaldeído (PFA) a 3,7% em 0,2 M HEPES a pH 7,4 usando a lavadora automática de placas.
    NOTA: Atenção: A PFA é tóxica por inalação, em contato com a pele e se engolida.
11. Incube por 20 minutos em temperatura ambiente.
12. Troque o meio de fixação por PBS de 50 μl usando a lavadora automática de placas.
    NOTA: As amostras agora estão prontas para serem retiradas do BSL3, se necessário.
    ATENÇÃO: A remoção de qualquer amostra de uma instalação BSL3 (Nível 3 de Biossegurança) está sujeita à avaliação de risco e validação do procedimento, além de depender das regulamentações aplicáveis para biossegurança.

2. Tingimento

1. Lave as células duas vezes com PBS de 50 μl.
2. Permeabilize células em 50 μl 0,1% Triton-X-100 em PBS por 10 min.
3. Lave as células três vezes com PBS. Adicione 20 μl de PBS contendo 1 μg/ml de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) e incube por 30 minutos em temperatura ambiente.
4. Lave as células três vezes em PBS e proteja as manchas da luz com papel alumínio.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caldo de Soja Triptico (TSB)	Fluka	22092
Sulfato de kanamicina	Sigma-Aldrich	60615
Frasco de tampa roscada de 250 ml	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Soro de Panturreiro Fetal (FCS)	Gibco	10270	Inativado por calor
Placa Greiner CELLSTAR de 384 poços	Sigma-Aldrich	M2062
Papel alumínio descascavel	Coautor de Elenco	6570
Dispensador de reagentes: "Dispensador de Reagentes Multidrop 384"	Termo Científica	5840150	Dispenser de reagentes alternativos pode ser utilizado.
Reagente de transfecção: "Lipofectamina RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Lavadora automática de placas: "Lavadora de placas ELx50-16"	BioTek	ELX5016	Esta lavadora de placas possui um coletor de 16 canais adequado para chapas de 384 poços. Ela cabe em um armário de biossegurança e possui uma tampa cobrindo a placa durante a lavagem, o que reduz o risco de produção de aerossóis. Arruelas alternativas de placas com características semelhantes poderiam ser usadas.
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397
PBS	Gibco	20012
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolva em 0,2 M HEPES buffer, pH 7,4. Armazene a -20 °C e descongele bem no dia anterior ao uso. Atenção, a PFA é tóxica por inalação, em contato com a pele e se engolida.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
SiRNA Kif11	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Dispositivos Moleculares	IXM IMAGING MSCOPE	Microscópio automatizado de imagem celular equipado com um estágio Z motorizado de precisão. Sistemas alternativos para microscopia automatizada e componentes alternativos para hardware e software especificados abaixo podem ser empregados.