Fotobranqueamento de pigmentos cianobacterianos para imagem de proteínas reguladoras do crescimento

Resumo

Fonte: Zhan, Y., et al. O fotobranqueamento permite a obtenção de imagens de super-resolução do anel FtsZ no cianobactério Prochlorococcus. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra o procedimento para fotobranqueamento de pigmentos em células cianobacterianas usando luz xenônica em condições frias para melhorar a imagem de fluorescência das proteínas reguladoras do crescimento.

Protocolo

1. Fotobranqueamento dos pigmentos de clorofila em uma etapa de bloqueio

1. Transfira a cobertura para o prato de tingimento. Adicione 50 μL de tampão bloqueante, que contém detergente não iônico 0,2% (v/v) e soro de cabra 3% (v/v), sobre a capa de cobertura.
2. Coloque toda a placa de coloração sobre gelo e mova-a sob a fonte de luz de xenônio para fotobranqueamento por pelo menos 60 minutos, com intensidade luminosa de 1.800 μmol fótons/^{m 2}·s.
3. Após o fotobranqueamento e o bloqueio, remova cuidadosamente o buffer de bloqueio absorvendo-o com a borda de um papel toalha.
   NOTA: A intensidade da luz de xenônio é tão alta que são necessários óculos escuros adequados para proteção ocular. Enquanto isso, envolva a fonte de luz e a placa com papel alumínio para evitar vazamentos de luz, que podem causar danos nos olhos. Verifique a capa a cada 15 minutos para garantir que ela permaneça úmida. Se estiver seco, adicione 50 μL de buffer bloqueador.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Partículas de poliestireno	Spherotech	PP-20-10	2,0-2,4 μm
Cobertura	Marienfeld	111580	18 mm ∅, Espessura nº 1
Etanol	Scharlau	ET00021000
Hidrobrometo de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P9155	peso mol 70.000-150.000
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	158127
Solução de glutaraldeído, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Sal Distódico, 2-hidrato	Biotecnologia do ouro	E-210-500
Base Trizma	Sigma	T1503
Lisozima	Sigma	L6876
Soro de cabra	Sigma	G9023
Fonte de luz XD-300 Xenônio			250 W