Detecção da suscetibilidade a antibióticos bacterianos usando um microscópio de espalhamento Raman estimulado

Resumo

Fonte: Zhang, M. et al., Teste Rápido de Suscetibilidade Antimicrobiana por Imagem de Espalhamento Raman Estimulado da Incorporação de Deutério em uma única Bactéria. J. Vis. Experiência (2022)

Este vídeo demonstra a aplicação da microscopia de espalhamento Raman estimulado para avaliar a suscetibilidade a antibióticos, acompanhando a atividade metabólica marcada com deutério. Ao monitorar sinais de carbono-deutério, o método permite a rápida detecção de populações bacterianas resistentes e suscetíveis.

Protocolo

1. D₂Tratamento de incorporação de O na presença de antibióticos (Figura 1a)

1. Verifique a concentração bacteriana medindo a densidade óptica (OD) com um fotômetro em comprimento de onda de 600 nm.
2. Dilua a solução bacteriana usando o meio normal de caldo Mueller-Hinton (MHB), que não contém deutério, para atingir uma concentração celular final de 8 x 10⁵ CFU/mL. Faça vórtice suavemente para misturar as células bacterianas.
3. Prepare 300 μL aliquotas da solução bacteriana em sete microtubos de 1,5 mL, e 600 μL aliquotas da solução bacteriana em um microtubo de 1,5 mL.
4. Adicione 4,8 μL de solução de antibiótico (gentamicina ou amoxicilina) (1 mg/mL) no microtubo contendo 600 μL da solução bacteriana, para atingir a concentração final de antibiótico em 8 μg/mL.
5. Retire 300 μL de solução dos 8 μg/mL de solução bacteriana contendo antibióticos e adicione a mais 300 μL de solução bacteriana, para produzir uma solução bacteriana com antibiótico diluído em dobro (4 μg/mL).
6. Repita a diluição serial em duas fases dos antibióticos teste, gentamicina ou amoxicilina, até que o microtubo com a menor concentração (0,25 μg/mL) seja alcançado, e descarte 300 μL do tubo. Para gentamicina e amoxicilina, as concentrações seriadas variam de 0,25 μg/mL a 8 μg/mL.
   1. Deixe um tubo sem antibióticos para controle em branco. Esse será o controle positivo para inspecionar a atividade metabólica bacteriana sem tratamento antibiótico, mas com tratamento com_D2O.
   2. Deixe um tubo sem antibióticos e sem_D2Opara o controle negativo.
7. Incube a alíquota bacteriana com um certo antibiótico (gentamicina ou amoxicilina) contendo meio MHB por 1 hora.
8. Durante a incubação, prepare uma diluição serial de antibióticos com meio contendo 100% de_D2Oe o mesmo gradiente de concentração de antibióticos preparados no passo 1.6. Para gentamicina e amoxicilina, as concentrações seriadas variam de 0,25 μg/mL a 8 μg/mL.
9. Após 1 hora de tratamento antibiótico, adicione 700 μL de antibiótico diluído serialmente e meio MHB contendo 100%_D2O aos 300 μL de bactérias pré-tratadas com antibiótico na mesma concentração (preparado no passo 1.6), respectivamente.
   1. Por exemplo, adicione 700 μL de meio MHB contendo 100% D₂O (contendo 8 μg/mL de antibiótico) aos 300 μL das bactérias pré-tratadas com antibiótico de 8 μg/mL. Da mesma forma, transfira para os tubos correspondentes da próxima concentração e homogeneize pipetando para cima e para baixo várias vezes.
   2. Adicione 700 μL de meio MHB 100% contendo D₂O, livre de antibióticos, a 300 μL de bactérias sem antibióticos (preparadas no passo 1.6.1) como controle em branco.
   3. Incube a 37 °C em um shaker de incubação a 200 rpm por mais 30 minutos.
      NOTA: Nessa etapa, a concentração final de D₂O no meio para o teste é de 70%.
10. Primeiro, centrifuge 1 mL de antibiótico e a amostra bacteriana tratada com D₂O a 6200 x g por 5 minutos a 4 °C, e depois lave duas vezes com água purificada. Por fim, fixe as amostras em solução de formol a 10% e armazene-as a 4 °C.

2. imagem por espalhamento Raman estimulado (SRS) da incorporação metabólica de D₂O em uma única bactéria

1. Lave 1 mL de solução bacteriana fixa com água purificada e depois centrifuge a 6200 x g por 5 minutos a 4 °C. Remova o sobrenadante. Enriqueça a solução bacteriana até cerca de 20 μL.
2. Deposite a solução bacteriana sobre um vidro coberto revestido com poli-L-lisina. Faça um sanduíche e laque a amostra para a imagem SRS.
3. Imageie bactérias na frequência vibracional C-D de 2168 cm-1 usando um microscópio SRS.
   1. Introduza e ajuste o comprimento de onda da bomba para 852 nm usando o software de controle do computador.
   2. Meça a potência do laser usando um medidor de potência. Ajuste a potência do laser de bombeamento na amostra para ~8 mW e a potência do laser Stokes na amostra para ~40 mW, ajustando a placa de meia-onda à frente da saída do laser.
      NOTA: No microscópio SRS, um laser femtossegundo sintonizável com taxa de repetição de 80 MHz fornece os lasers de excitação de bomba (680 a 1300 nm) e Stokes (1045 nm).
4. Ajustando os parafusos dos espelhos de reflexão, alinhe espacialmente os feixes de bomba e Stokes e direcione os dois feixes para um microscópio vertical equipado com um sistema de espelhos galvo 2D para varredura a laser.
   1. Use uma meta de imersão 60x para focar a bomba e os lasers Stokes na amostra.
   2. Use um condensador de óleo para coletar os sinais da amostra na direção direta.
   3. Use um filtro passa-banda para filtrar o laser Stokes antes de direcioná-lo para um fotodiodo.
   4. Extraia o sinal Raman estimulado por um amplificador lock-in e detecte os sinais por um fotodiodo.
5. Defina cada imagem SRS para conter 200 x 200 pixels e o tempo de permanência dos pixels para 30 μs no painel de controle do software. O tempo total de aquisição para uma imagem é de ~1,2 s. Defina o tamanho do Step para 150 nm, então o tamanho da imagem é cerca de 30 x 30^{μm 2}. Imagine pelo menos três campos de visão para cada amostra.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Modulação acusto-óptica	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	Modulação do feixe de laser Stokes
Amoxicilina	Sigma Aldrich	A8523-5G
Filtro passa-banda	Chroma	HQ825/150m	Bloqueie o feixe de laser Stokes antes do fotodiodo
Cloreto de cálcio	Sigma Aldrich	C1016-100G	Ajuste de cations
Caldo Mueller-Hinton ajustado por catiões	Fisher Scientific	B12322	Teste de suscetibilidade antimicrobiana de microrganismos por métodos de diluição de caldo
Centrífuga	Termo Científica	75002542
Óculos de capa	VWR	16004-318
Tubo de cultura com tampa de pressão	Marca Fisher	149569B
Óxido de deutério		151882	Solvente orgânico para dissolver antibióticos
Óxido de deutério-d6	Sigma Aldrich	156914	Solvente orgânico como padrão para calibrar sistemas de imagem SRS
Escherichia coli BW 25113	O Centro de Estoque Genético de Coli	7636
Tubos de microcentrífuga de polipropileno Eppendorf 1,5 mL	Marca Fisher	05-408-129
Sulfato de gentamicina	Sigma Aldrich	G4918
Filtros hidrofílicos de polivinilideno flúor	Millipore-Sigma	SLSV025NB	Tamanho do poro 5 μm
Laser pulsado de femtossegundos InSight DeepSee	Espectros-Física	Modelo: insight X3	Fonte laser sintonizável e fonte laser fixa a 1045 nm para imagens SRS
Amplificador de bloqueio	Instrumento de Zurique	HF2LI	Demodular os sinais SRS
Condensador de óleo	Olympus	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)	Coleção de Cultura do Tipo Americano	ATCC 47085
Fotodiodo	Hamamatsu	S3994-01	Detector
Tubo cônico de polipropileno 15 mL	Falcon	14-959-53A
Filtros de polipropileno	Termo Científica	726-2520	tamanho dos poros 0,2 μm
Placas de Petri estéreis	Corning	07-202-031
Seringa 10 mL	Marca Fisher	14955459
Espectrofotômetro UV/Vis	Beckman Coulter	Modelo: DU 530	Medindo densidade óptica em comprimento de onda de 600 nm
Misturador de vórtice	VWR	97043-562
Objetivo hídrico	Olympus	UPLANAPO/IR	60×, NA 1,2