Estabelecimento de infecção bacteriana em larvas de Drosophila

Neste artigo

Resumo

Fonte: Hiroyasu, A., D et al., Extração de Hemocitos de Larvas de Drosophila melanogaster para Infecção e Análise Microbiana. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o procedimento para estabelecer uma infecção bacteriana em larvas de Drosophila , colocando-as em uma gota bacteriana e furando-as com uma agulha de tungstênio. As larvas são então incubadas em uma placa de ágar sulcada e rica em nutrientes para estudar as interações hospedeiro-patógeno.

Protocolo

1. Infecção in vivo

Aqueça a placa de ágar de suco de fruta Drosophila em temperatura ambiente por 15 minutos.
1. Adicione 30 g de ágar a 700 mL de água e faça autoclave por 40 minutos.
2. Dissolva 0,5 g de parabeno de metil em 10 mL de etanol absoluto.
3. Adicione a solução de parabeno de metilo a 300 mL de concentrado de suco de fruta.
4. Misture rapidamente o concentrado de suco na solução de ágar autoclavado e dispense 5 mL em placas de Petri de 10 × 35 mm.
5. Depois que as placas esfriarem por 15 minutos, guarde-as a 4 °C.
Prepare larvas de 3º estádio.
Coloque a pasta de fermento em uma placa de ágar. Faça um corte fino na placa de ágar onde as larvas podem migrar para evitar a secagem (Figura 1A). Monte uma agulha de tungstênio pontiaguda de 0,001 mm com pinças de fixação usando filme de parafina (Figuras 1B, C).
Pipete 50 μL de Coxiella burnetii expressora de alto título mCherry (5,95×10⁹ GE/mL) sobre o filme de parafina sob o microscópio estereoscópico e coloque as larvas no poço de bactérias.
Coloque as larvas na piscina de bactérias, espete-as com uma agulha de tungstênio (Figura 3D) e transfira-as para uma placa de ágar (Figura 1E).
Transfira o meio patógeno restante para a placa de ágar e fele a placa com filme de parafina.
Mantenha as larvas no prato em ar úmido até o tempo desejado após a infecção (Figura 1F). Neste experimento, larvas infectadas por C. burnetii permanecem na placa por 24 horas.

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Resultados

Figura 1: Infecção in vivo. A) Placas de suco de fruta e açúcar de ágar de Drosophila e pasta de levedura são usados para incubação de larvas infectadas in vivo . Cortes são feitos na placa de ágar para facilita...