Imagem Confocal de Alta Resolução de Hemocitos de Drosophila Infectados por Patógenos

Resumo

Fonte: Hiroyasu, A., et al. Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra imagens confocais de alta resolução de hemocitos de Drosophila melanogaster infectados com Coxiella burnetii para visualizar a localização do patógeno em 3D, permitindo uma análise detalhada da dinâmica intracelular da infecção e das interações hospedeiro-patógeno.

Protocolo

1. Imagem Confocal
   1. Configure o microscópio confocal para imagens em três cores de DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol), EGFP (proteína fluorescente verde aprimorada) e mCherry. Use a seguinte configuração: excitação DAPI (ex) 405 nm, emissão (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
   2. Coloque a amostra no microscópio e foque nela usando um objetivo de abertura numérica (NA) de 63X/1,4. Localize os hemócitos desejados no campo de visão para a imagem.
   3. Ajuste a potência do laser e os ganhos do detector para alcançar a exposição adequada da amostra. Verifique múltiplos planos Z para garantir que o nível de exposição seja adequado para toda a espessura da amostra.
   4. Encontre as posições superior e inferior no eixo z de um hemócito inteiro. Defina essas posições como as posições inicial e final para a secção em z.
   5. Use apenas o zoom de varredura para capturar a área que contém o hemócito. Fatores de zoom de 3X são frequentemente usados.
   6. Colete a série de imagens em resolução apropriada, como 1024 x 1024 pixels no plano x-y e espaçamento de 0,3 μm na dimensão z.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coxiella burnetii - mCherry	Dr. Heinzen, R.
Vidro de cobertura de microscópio	Fisher Scientific	12-545-80
4',6-diamidino-2-fenilindol	Thermo Fisher Scientific	62247
Microssope confocal	Leica	Microscópio Confocal de Varredura a Laser de Luz Branca TCS SP8-X
Lâminas de microscópio	Fisher Scientific	12-552-3