Análise de Expressão Gênica de Células Únicas a partir de Patógenos Extraídos de Plantas

Resumo

Fonte: Rufián, J. S., et al. Análise de célula única da expressão dos genes de Pseudomonas syringae no tecido vegetal. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra um método para analisar a expressão gênica em bactérias patogênicas extraídas de plantas no nível de célula única, usando um fator de transcrição marcado fluorescente. A imagem confocal revela heterogeneidade na expressão gênica da virulência, destacando a diversidade funcional dentro de uma população bacteriana clonal.

Protocolo

1. Análise unicelular das bactérias extraídas do apoplasto

1. Prepare uma solução de agarose a 1,5% em água destilada. Depois de derretido, adicione volume suficiente para preencher o espaço entre duas lâminas de microscopia colocadas lado a lado e coloque outra lâmina por cima (Figura 1). Deixe secar por 15 minutos e remova cuidadosamente o ferro-lápias colocado em cima. Usando uma lâmina, corte a almofada de agarose em pedaços de 5 mm x 5 mm pouco antes do uso.
2. Paralelamente, centrifuge 1 mL da bactéria extraída do apoplasto a 12.000 x g por 1 minuto em temperatura ambiente, remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda o pellet em 20 μL de água para concentrar as células. Coloque uma gota de 2 μL das células concentradas sobre um revestimento de 0,17 mm e cubra a gota com um pedaço de 5 mm x 5 mm da almofada de agarose obtida anteriormente no passo 1, como representado na Figura 1.
3. Visualize a preparação bacteriana sob o microscópio confocal (veja a Tabela de Materiais). Para identificar bactérias fluorescentes verdes, utilize o laser de excitação a 488 nm e um filtro de emissão que varia de 500 nm a 550 nm. Para identificar todas as bactérias, use o campo claro e funda ambos os campos.
4. Processe as imagens confocais usando Fiji (veja Tabela de Materiais). Para isso, use o plugin MicrobeJ para identificar o contorno da célula bacteriana e medir a intensidade de fluorescência dentro dela.
   NOTA: A aquisição de imagem a partir de bactérias isoladas (não agrupadas) é recomendada para esta análise.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática da montagem e preparação da almofada de ágar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cobertura de 0,17 mm			Sem requisitos especiais
Malha metálica de 1,6 x 1,6 mm	Buzifu		Malha de tela de fibra de vidro
Tubos cônicos de 50 mL	Sarstedt
Agarose	Merk
Microscópio Confocal Stellaris	Leica Microsystems
Software de Fiji