Modelo intestinal in vitro para avaliar adesão bacteriana e internalização

Resumo

Fonte: Calatayud Arroyo, M., et al. Avaliação da Viabilidade de um Consórcio Bacteriano Sintético na Interface In Vitro Intestino-Microrganismo. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra um modelo intestino-microrganismo in vitro para estudar a viabilidade bacteriana. Uma cocultura de células Caco-2 e HT29-MTX é incubada com bactérias pré-tratadas sob condições digestivas simuladas. A integridade da barreira epitelial é avaliada usando resistência elétrica transepitelial, e frações do meio, muco solubilizado, lisado celular e detritos celulares são coletadas para análise posterior.

Protocolo

1. Cepas e condições culturais

NOTA: A comunidade oral sintética era composta por cepas comumente presentes no microbioma oral.

1. Obtenha as seguintes cepas da Coleção Americana de Cultura Tipo (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) e Streptococcus mitis (ATCC 49456).
2. Adquira Veillonella parvula da Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM 2007), Streptococcus sanguinis da Coleção de Bactérias BCCM/LMG (LMG 14657), e utilize Streptococcus salivarius cepa TOVE-R e Streptococcus oralis.

2. Desenvolvimento de uma comunidade multiespécie representativa do microbioma oral

NOTA: Gerar uma comunidade sintética para simular a potencial capacidade de adesão das bactérias orais ao epitélio intestinal in vitro . Cultive bactérias em placas de ágar sanguíneo suplementadas com 5 μg/mL de hemin, 1 μg/mL de menadiona e 5% de sangue estéril de cavalo defibrinado. Resumindo:

1. Dissolva 100 mg de hemin em 2 mL de 1 M hidróxido de sódio (NaOH) e adicione 100 mL de água destilada autoclavada. Guarde em um recipiente escuro. Esterilize através de um filtro de 0,22 μm antes de adicionar ao meio.
2. Dissolva 100 mg de menadiona em 20 mL de etanol 96%. Esterilize através de um filtro de 0,22 μm antes de adicionar ao meio.
3. Prepare 1 L de meio de ágar sanguíneo (veja a Tabela de Materiais) conforme as instruções do fabricante e o autoclave. Deixe esfriar antes de adicionar o sangue do cavalo e os suplementos. Misture e despeje os pratos.
4. Prepare caldo modificado de Infusão Cerebral (BHI). Adicione 5 μg/mL de hemin e 1 μg/mL de menadiona após a autoclavagem.
5. Dispense 9 mL do meio em tubos Hungate e feche com uma rolha de borracha e uma tampa de alumínio. Lave os tubos com nitrogênio/dióxido de carbono ou N₂/CO₂ (90%/10%).
6. Pegue 1 mL de meio anaeróbico com uma seringa e coloque-o em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Escolha colônias individuais de cada espécie bacteriana, ressuspenda no meio e transfira de volta para o BHI modificado anaeróbico. Incubar por 48 horas a 37 °C, exceto para S. salivarius, que deve ser incubado por 24 horas.
7. Se necessário, confirme a pureza das culturas antes de montar a comunidade sintética. Resumindo:
   1. Extrair DNA das culturas líquidas e amplificar o gene 16S rRNA usando os primers 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) e 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT), e o seguinte programa: 5 minutos a 95 °C, 30 ciclos de 95 °C por 1 min, 55 °C por 1 min e 72 °C por 1,5 min, seguido por uma etapa final de extensão de 5 min a 72 °C.
   2. Purifique o produto da reação em cadeia da polimerase (PCR) com um kit comercial (veja Tabela de Materiais), seguindo as instruções do fabricante.
   3. Realize a reação de sequenciamento dos produtos purificados em um volume total de 10 μL contendo 0,5 μL de corante (veja Tabela de Materiais), 3,2 pmol de primer M13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAGTCACGAC), 2,0 μL de tampão de sequenciamento 5x e 20 ng de molho, utilizando um sistema comercial de sequenciamento com kit (veja Tabela de Materiais).
      NOTA: Fizemos esse procedimento comercialmente.
   4. Realize uma busca BLAST em todas as sequências (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para determinar o táxon conhecido mais próximo e compare com a sequência da cepa original usando a ferramenta online RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) e o serviço de alinhamento SINA (https://www.arb-silva.de/aligner/).
8. Meça o número de células ao final da incubação, usando citometria de fluxo e coloração SYBR Green/Propidium Iodeto. Dilua as culturas para 10⁵ células ^mL-1, usando BHI modificado.
9. Adicione 1 mL de S. mitis a 75 mL de BHI anaeróbico e incube até a fase estacionária (6 h). Em seguida, colete 0,75 mL de cada cepa diluída e misture em condições anaeróbicas.
10. Depois que todas as culturas estiverem misturadas, pegue 1 mL do microcosmo e adicione aos 75 mL de BHI. Incubar a comunidade sintética sob 10% de_CO2, 10% de hidrogênio (_H2), 80% de N, por 48 horas a 37 °C e 200 rpm (veja Tabela de Materiais).
11. Meça a densidade celular como em 2,8. antes de apresentar a comunidade ao modelo celular. A composição da comunidade pode ser avaliada com PCR quantitativa em tempo real. Além disso, utilize o sequenciamento do amplicon do gene 16S rRNA para fornecer informações sobre os membros iniciais presentes. Para qualquer um dos protocolos de confirmação de identidade, use o cDNA como modelo para indicar as bactérias transcrevendo proteínas ativamente, e use o DNA como modelo para revelar a presença/ausência das cepas.

3. Práticas Gerais de Cultura Celular

NOTA: Obtenha linhas celulares utilizadas da Coleção Europeia de Culturas Celulares Autenticadas (Caco-2 ECACC 86010202 e HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, Public Health England, Reino Unido). Reagentes para cultura celular podem ser adquiridos (veja Tabela de Materiais), salvo indicação em contrário.

1. Manutenção e passagem de linhas celulares Caco-2 e HT29-MTX: As células Caco-2 e HT29-MTX são rotineiramente cultivadas em frascos de cultura de^{tecidos de 25 cm 2} contendo meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado (Tabela 1). As células são tripsinizadas quando se atinge a confluência de 60–70%.
   1. Remova o meio de cultura celular dos frascos. Lave duas vezes com 5 mL de PBS sem cálcio/magnésio (Ca⁺⁺/Mg⁺⁺).
   2. Adicione 2 mL de uma solução de tripsina de 0,5 mg/L e 0,22 g/L de ácido etilenodiamine tetraacético (EDTA). Distribua a solução de tripsina movendo suavemente o frasco. Remova 1,5 mL da solução de tripsina e incube o frasco a 37 °C por 10 minutos.
   3. Verifique ao microscópio se as células estão descoladas da superfície do frasco. Incube por mais 5 minutos, se necessário.
   4. Adicione 5 mL de meio de cultura celular suplementada ao cantil para inativar a tripsina. Pipete para cima e para baixo para obter uma suspensão homogênea de célula única.
   5. Imediatamente, pegue uma alíquota de 50 μL da suspensão celular e misture com solução estéril de azul de Tripano 0,4% em proporção 1:1 (v/v) para células Caco-2 ou 1:5 v/v para HT29-MTX. Misture pipetando e carregue em uma câmara de contagem (veja Tabela de Materiais).
   6. Conte as células viáveis (glóbulos brancos brilhantes) sob o microscópio (veja as instruções do fabricante).
   7. Semente em um novo frasco com densidade de 4 x 10⁵ células/^{cm 2} e 1 x 10⁴ células/^{cm 2}, respectivamente para Caco-2 e HT29-MTX.
      NOTA: (1) As células Caco-2 se diferenciam e formam junções apertadas ao atingir a confluência. É extremamente importante evitar a superconfluência antes da tripsinização. O crescimento excessivo de células no frasco pode causar falha no descolamento celular após tripsinização e/ou aglomeração celular. (2) As células HT29-MTX são células produtoras de muco com alta atividade metabólica. Essas características podem causar uma rápida acidificação do meio de cultura celular, especialmente se as células estiverem em alta densidade. O tampão de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanolsulfônico (HEPES) pode ser adicionado ao meio de cultura celular (Tabela 1) para manter o pH entre 7 e 7,2. Se o pH cair, o meio pode ser trocado quando a confluência for inferior a 50%. No entanto, se a confluência >50%, a cultura celular deve ser dividida.

4. Montagem de um modelo de célula multicompartimento simulando a interface intestino-hospedeiro-microrganismo

NOTA: Completar a cocultura em poços de câmara dupla (diâmetro 24 mm, tamanho do poro 0,4 μm; ver Tabela de Materiais).

1. Adicione 1,5 mL de meio completo de cultura celular ao compartimento apical e 2 mL ao basal. Pré-incubar por 20–30 minutos para obter uma distribuição uniforme da suspensão celular durante a semeadura.
2. Tripsinize a cultura celular de Caco-2 e HT29-MTX conforme descrito na seção 3. O procedimento de tripsinização deve ser seguido com precisão para alcançar uma distribuição homogênea de ambas as linhas celulares, em uma única suspensão celular, sem aglomerados.
3. Conte as células viáveis conforme descrito em 3.1.8.
4. Ajuste a densidade celular para 6,5 x 10⁴ células/cm² em uma proporção 90/10 de células Caco-2/HT29-MTX.
5. Homogeneize as suspensões celulares e adicione o volume correspondente de células Caco-2 e HT29-MTX a um recipiente estéril pré-preenchido com meio de cultura celular suplementado. Remova o meio pré-incubado do lado apical da câmara por aspiração.
6. Misture suavemente a suspensão celular pipetando e transfira 1,5 mL para o compartimento apical das inserções da câmara. O procedimento de semeadura exige uma homogeneização constante da suspensão celular, pois as células tendem a sedimentar. Dependendo da experiência do usuário e da velocidade de trabalho, a suspensão das células deve ser misturada após a dispensação de 1 a 3 poços.
7. Mova as placas suavemente para frente e para frente e depois da direita para a esquerda para a direita (5–10 vezes) para obter uma distribuição uniforme das células no poço. Transfira para a incubadora e repita o movimento das placas.
8. Mantenha a cocultura das células Caco-2/HT29-MTX por 15 dias, renovando os compartimentos apical e basal a cada 2 dias com DMEM suplementado. Após esse período, o meio de cultura celular pode ser substituído por DMEM suplementado sem solução antibiótica/antimicótica.
9. Mantenha o sistema até 20–21 dias após a semeadura, renovando o meio a cada 2 dias.
10. Meça a integridade da barreira epitelial antes de iniciar o ensaio, utilizando um Sistema de Resistência Elétrica (veja Tabela de Materiais), seguindo as instruções do fabricante.
    1. Certifique-se de que o equipamento de resistência elétrica transepitelial (TEER) esteja totalmente carregado (>24 h) antes de iniciar as medições.
    2. Desconecte o equipamento TEER da fonte de alimentação e cubra com um saco plástico de autoclave. Faça um furo no saco para introduzir o eletrodo e conecte na entrada do medidor. Borrife com 70% de etanol/água (v/v) antes de introduzir o equipamento TEER no gabinete de fluxo.
    3. Para desinfetar o eletrodo, mergulhe as pontas do eletrodo em uma solução de etanol/água (v/v) a 70% por 15 minutos. Deixe secar ao ar por 15 segundos. Enxague o eletrodo em meio de cultura celular pré-aquecido.
    4. Retire as células da incubadora e permita que as células atinjam a temperatura ambiente dentro do gabinete de fluxo.
    5. Certifique-se de que o medidor está desconectado do carregador. Coloque o interruptor de modo em Ohms e ligue o interruptor de energia.
    6. Meça a resistência da célula imergindo o eletrodo com a ponta mais curta no insert e a ponta mais longa fora do poço. Mantenha o eletrodo em um ângulo de 90° em relação à inserção da placa.

5. Sobrevivência bacteriana após condições de trânsito gastrointestinal in vitro

NOTA: Prepare todas as diluições com água ultrapura. Esterilize todas as soluções através de um filtro de 0,22 μm e realize o procedimento de digestão em condições estéreis.

1. Digestão oral:
   1. Coloque 3 mL da comunidade bacteriana em um tubo estéril de 50 mL, misture com 3 mL de fluido salivar simulado (SSF), contendo (em mmol ^L-1): cloreto de potássio (KCl), 15,1; dihidrogênio fosfato de potássio (_{KH 2}PO₄), 3,7; bicarbonato de sódio (_{NaHCO 3}), 6,8; cloreto de magnésio hexahidratado [MgCl₂(H₂O)₆], 0,5, carbonato de amônio [(NH₄) CO₃], 0,06; ácido clorídrico (HCl), 1,1; Diidratado de cloreto de cálcio [CaCl₂(H₂O)₂], 0,75. Adicione 75 U/mL de α-amilase da saliva humana tipo IX-A e 2 g/L de mucina do estômago suíno tipo II ao SSF.
   2. Incube a mistura por 2 minutos a 37 °C e 100 rpm. Colete uma amostra de 2 mL para extração de DNA e quantificação por citometria de fluxo (S1).
2. Digestão gástrica:
   1. Adicione 4 mL de líquido gástrico simulado (SGF), contendo (em mmol L-1): KCl, 6,9; KH₂PO₄, 0,9; _{NaHCO 3}, 25; cloreto de sódio (NaCl), 47,2; MgCl₂(H₂O)₆, 0,1; (NH₄)CO₃, 0,5; HCl, 15,6; CaCl₂(H₂O)₂, 0,075. Além disso, o SGF continha 2 g/L de mucina do estômago suíno tipo II.
   2. Meça o pH e ajuste para pH 3 com 1 M de HCl, se necessário. Incube a 37 °C e 100 rpm. Colete uma amostra de 2 mL (S2).
3. Digestão do intestino delgado:
   1. Adicionar 4 mL de fluido intestinal simulado (SIF) contendo (em mmol L-1): KCl, 6,8; KH₂PO₄, 0,8; NaHCO₃, 85; NaCl, 38,4; MgCl₂(H₂O)₆, 0,33; HCl, 8.4; CaCl₂(H₂O)₂, 0,3, para o tubo digestivo.
   2. Ajuste para pH 7 com 1 M de NaOH, se necessário. Incube a 37 °C e 100 rpm. Colete uma amostra de 2 mL (S3).

6. Capacidade de colonização bacteriana após condições de trânsito gastrointestinal in vitro

1. Centrifuge 2 mL da digestão do intestino delgado por 10 minutos a 2.650 x g.
2. Remova o sobrenadante e misture o pellet bacteriano com 5 mL de DMEM suplementado sem antibióticos e antimicóticos.
3. Tinga e quantifique células intactas/danificadas usando um citômetro de fluxo (veja a Tabela de Materiais).
4. Ajuste a densidade celular para 10⁵ células viáveis/mL diluindo DMEM suplementado sem antibióticos e antimicóticos.
5. Remova o meio apical do sistema transwell e adicione 1,5 mL da suspensão bacteriana. Co-cultura do sistema por 2 horas sob condições gerais de cultura celular (37 °C, 95% de umidade, 5% de CO₂).
   NOTA: Esse tempo pode ser estendido por até 48 horas, dependendo do protocolo experimental necessário. A cocultura pode ser mantida em uma incubadora diferente daquela usada para manutenção celular rotineira, para evitar contaminações.
6. Meça os valores TEER após a incubação para avaliar a integridade da barreira epitelial conforme descrito no 4.11.
7. Ao concluir o tempo de incubação, remover o meio apical e coletar 0,5 mL para análises adicionais (S4). Uma subamostra de meio pode ser usada para avaliação da viabilidade celular por meio do ensaio de lactato desidrogenase (LDH) (veja Tabela de Materiais), seguindo as instruções do fabricante.
8. Adicione 0,5 mL de 10 mM de N-acetilcisteína em HBSS (tampão NAC) para solubilizar o muco produzido pelo HT29-MTX e recuperar as bactérias aderidas. Incubar as placas a 37 °C por 1 hora, sob agitação (135 rpm, veja Tabela de Materiais).
9. Recupere o NAC-HBSS em um tubo microcentrífuga (S5) e lave as células duas vezes com 1 mL de DPBS.
10. Adicione 0,5 mL de 0,5% de Triton X-100 (v/p) sobre as monocamadas, desregule as células pipetando, recupere o líquido e faça vórtice por 1 minuto. A rapidez é fundamental para evitar danificar as células bacterianas com o detergente.
11. Centrifuge as células por 5 minutos a 2.650 x g, e separe o sobrenadante (S6) e o pellet (S7).

7. Análise de Amostras

NOTA: Analise amostras coletadas (S1-S7) para avaliar a viabilidade bacteriana e o potencial de adesão às células intestinais, após uma digestão gastrointestinal simulada.

1. Viabilidade bacteriana: Passe amostras S1-S5 duas vezes por um filtro de 0,45 μm e quantifique as células bacterianas usando coloração de células vivas/mortas e citometria de fluxo, conforme indicado no passo 2.8.
2. Potencial de aderência: Prepare diluições seriadas (-1 a -8) para S1-S6 e estrie 10 μL em ágar sanguíneo e placas BHI modificadas. Incubar a 37 °C em condições anaeróbicas por 24–48 horas. Folheie o mesmo volume de S7 não diluído.
   1. Identificação taxonômica de bactérias aderidas:
      1. Escolha colônias individuais com um laço de cultura e ressuspenda cada uma em 10 μL de água livre de nuclease. Colete 4 μL dessa suspensão e utilize-a como modelo para amplificação por PCR do gene 16S rRNA usando os primers e condições descritos na 2.7.1.
      2. Realize o sequenciamento seguindo o protocolo da 2.7.3 e valide a sequência usando o procedimento incluído na 2.7.4.
3. Faça análises adicionais a jusante, como extração total de DNA, quantificação de qPCR e/ou sequenciamento de amplicons de 16S rRNA, extração de RNA e perfilamento transcriptômico conforme desejado.
   NOTA: A quantificação da citometria de fluxo foi realizada imediatamente após a amostragem. Como controle para células permeabilizadas por membrana, foi utilizada uma amostra exposta a 70 °C por 3 minutos. O ruído de fundo foi avaliado medindo, com citometria de fluxo, os fluidos digestivos ou amostras obtidas do modelo de cultura celular sem bactérias. Cada amostra foi medida em triplicado.

 

Tabela 1: Descrição das linhas celulares e composição do meio para manutenção da cultura celular.

Cultura celular	Aderente/ Suspensão	Meio de Cultivo	Suplementos gerais	Suplementos específicos	Tempo dobrando	Condições de incubação
Caco-2 (ECACC 86010202)	Adepto	Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 4,5 g/L de glicose	Soro fetal bovino inativado (10% v/v) Penicilina (100 U/mL)* Estreptomicina (0,1 mg/mL)* Anfotericina (0,0025 mg/mL)*	Glutamax (4 mM) Aminoácidos não essenciais (1% v/v) Piruvato (1 mM)	65–72 h	Incubadora de 95% de umidade e 10% de CO2 CO 2 (veja a Tabela de Materiais)
HT29-MTX (ECACC 12040401)	Adepto			HEPES (1 mM)	20–24 h
* Antibióticos e antifúngicos foram removidos do meio de cultura celular 2 dias antes do início dos ensaios.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CEPAS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans	Coleção de Cultura do Tipo Americano	ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum	Coleção de Cultura do Tipo Americano	ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis	Coleção de Cultura do Tipo Americano	ATCC 33277
Prevotella intermedia	Coleção de Cultura do Tipo Americano	ATCC 25611
Streptococcus mutans	Coleção de Cultura do Tipo Americano	ATCC 25175
Streptococcus sobrinus	Coleção de Cultura do Tipo Americano	ATCC 33478
Actinomyces viscosus	Coleção de Cultura do Tipo Americano	ATCC 15987
Streptococcus salivarius TOVE-R
Streptococcus mitis	Coleção de Cultura do Tipo Americano	ATCC 49456
Streptococcus sanguinis	Coleção de Bactérias BCCM/LMG	LMG 14657
Veillonella parvula	Instituto Leibniz DSMZ - Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares	DSM 2007
Streptococcus gordonii	Coleção de Cultura do Tipo Americano	ATCC 49818
LINHAS CELULARES
Células Caco-2	Coleção Europeia de Culturas Celulares Autenticadas	86010202
Células HT29-MTX	Coleção Europeia de Culturas Celulares Autenticadas	12040401
REAGENTES E CONSUMÍVEIS
Caldo Brain Heart Infusion (BHI)	Oxoide	CM1135
Ágar de Sangue 2	Oxoide	CM0055	Meio de ágar sanguíneo
Menadione	Sigma	M9429
Hemin	Sigma	H9039
Sangue de cavalo defibrinado 5% estéril	E&O Laboratories Ltd,	P030
InnuPREP PCRpure Kit	Analytik Jena	845-KS-5010250	Kit de purificação PCR
Big Dye	Biossistemas Aplicados	4337454	Corante para sequenciamento
Kit de sequenciamento de ciclos ABI Prism BigDye Terminator v3.1	Biossistemas Aplicados	4337456
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
Prodídio iodeto	Invitrogen	P1304MP
Frascos de cultura T25 não revestidos, tratados com cultura celular, ventilados, estéreis	VWR	734-2311
Solução de tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Solução Trypan Blue0,4%, líquida, filtrada por estéril	Sigma-Aldrich	T8154
Fosfato-tamponado-salina (PBS)	Gibco	14190250
Meios de cultivo celular DMEM, com GlutaMAX e Piruvato	Tecnologias de vida	31966-047
Inserções de cultura celular de membrana poliéstera Corning Transwell	Sigma-Aldrich	CLS3450-24EA
Mucina do estômago suíno Tipo II	Sigma-Aldrich	M2378
Soro fetal bovino inativado	Greiner Bio One	758093
Antibiótico-Antimicoótico (100X)	Gibco	15240062
Triton X 100 para biologia molecular	Sigma-Aldrich	T8787
DPBS sem cálcio, magnésio	Gibco	14190-250
Kit de Ensaio de Citotoxicidade Pierce LDH	Thermo Fisher Scientific	88953
Poço Corning HTS Transwell-24, tamanho de poros 0,4 μm	Corning Costar Corp	3450
Água livre de nuclease	Eletroforese Serva	28539010
EQUIPAMENTO
Câmara de contagem Neubauer melhorada	Carl Roth	T729.1
Citômetro de fluxo BD Accuri C6	BD em Biociências	653118
PowerLyzer 24 Homogeneizador	MoBio	13155
Ciclador Térmico T100	BioRad	186-1096
Sistema de flush	Feito sob medida	-
Incubadora InnOva 4080	New Brunswick Scientific	8261-30-1007	Shaker para 2.10
Incubadora de CO₂ Memmert	Memmert GmbH & Co.	ICO150med
Millicell ERS (Sistema de Resistência Elétrica)	EMD Millipore, Merck KGaA	MERS00002
Millipore Milli-Q acadêmico, sistema de água ultra pura	Millipore, Merck KGaA	-
Shaker (ROCKER 3D básico)	IKA	4000000	Shaker para 6.10