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1. Isolar DNA genômico de tecido vegetal usando um kit de extração genômica
- Obtenha tecido das folhas cítricas cortando uma folha inteira nova de uma árvore cítrica usando tesoura limpa e coloque a folha em um saco plástico limpo para sanduíches.
NOTA: O saco contendo o papel de folha deve ser colocado em uma geladeira de 4 °C ou em gelo em um recipiente isolado o mais rápido possível após a coleta para evitar estragos. - Adicione uma pequena quantidade de nitrogênio líquido para resfriar um pilão. Enquanto estão frias, use tesoura para cortar um pequeno pedaço de tecido foliar, de aproximadamente 1 polegada quadrada. Coloque o tecido cortado no almofariz para congelá-lo instantaneamente. Adicione mais nitrogênio líquido, se necessário.
NOTA: Luvas isolantes devem sempre ser usadas ao manipular nitrogênio líquido. - Moa rapidamente o tecido vegetal até virar um pó fino usando o almofariz. Continue moendo até que o nitrogênio líquido evapore completamente e fique um pó verde fino.
- Resfrie brevemente uma espátula metálica em nitrogênio líquido por 10 a 15 segundos, depois recolha o tecido moído dentro do argamassa em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, usando a espátula.
- Adicione 600 μL de Solução de Lise Nucleal (veja Tabela de Materiais) usando uma pipeta de 1000 μL. Faça vórtice na amostra por 1 a 3 segundos, depois incube em banho-maria a 65 °C por 15 minutos.
- Adicione 3 μL de Solução RNase ao lisado usando uma pipeta de 10μL, invista o tubo 2 a 5 vezes para misturar e incube a 37 °C em uma incubadora de armário por 15 minutos.
NOTA: Deixe a mistura esfriar até a temperatura ambiente antes de prosseguir. - Adicione 200 μL de Solução de Precipitação de Proteínas, faça vórtice em alta velocidade por 20 s e depois centrifuge por 3 minutos a 13.000 x g para formar um pellet firme. Enquanto a amostra está sendo centrifugada, adicione 600 μL de isopropanol em temperatura ambiente a um tubo novo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Usando uma pipeta de 1000 μL, remova cuidadosamente o sobrenadante da amostra centrífuga, transferindo-a para o tubo novo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo isopropanol. A bola agora pode ser descartada.
NOTA: Evite contaminar o sobrenadante com proteína deixando uma quantidade minúscula de sobrenadante acima do pellet. - Inverta o tubo até que o DNA fique visível como uma massa de fios em forma de fio, depois centrifuge a 13.000 x g por 1 minuto em temperatura ambiente.
- Decante o sobrenadante, adicione 600 μL de etanol a 70% ao pellet, invista o tubo várias vezes para lavar o DNA e centrifuge a 13.000 x g por 1 minuto.
- Aspire cuidadosamente o etanol, deixando a bola solta de DNA, depois abra e inverta o tubo, apoiando-o sobre papel absorvente. Deixe secar ao ar em temperatura ambiente por 15 minutos.
- Adicione 100 μL de Solução de Reidratação de DNA ao pellet de DNA seco, depois incube o DNA em um banho-maria a 65 °C por 1 hora, enquanto mistura periodicamente batendo no tubo.
- Coloque 1 μL de água purificada em uma microcuveta e insira-a em um espectrofotômetro para ser usado como um blank. Calcule a concentração de DNA presente colocando 1 μL da amostra na microcuveta e inserindo-a no espectrofotômetro. A concentração de DNA (ng/μL) pode ser calculada como (A260 -A 320) × fator de diluição × 50 ng/μL.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. A amostra pode ser armazenada a 4 °C.