Produção de Pseudovírus Utilizando Transfecção de Plasmídeos em Células Humanas

Resumo

Fonte: Chang, X., et al. Preparação de Vírus Pseudotipados da Influenza Aviária H5 pelo Método de Transfecção com Fosfato de Cálcio e Medição da Atividade Neutralizante de Anticorpos. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a produção de pseudovírus da influenza em células humanas utilizando a transfeção de plasmídeo mediada por fosfato de cálcio, permitindo a geração segura de partículas virais de ciclo único para aplicações posteriores, como ensaios de neutralização de anticorpos em condições de nível de biossegurança 2.

Protocolo

1. Embalagem de pseudovírus com transfeção por fosfato de cálcio

1. Prepare suspensões simples de células HEK293FT (9 x 10⁵ por mL) em meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) completo (Tabela 1). Adicione 10 mL da suspensão simples de células a um frasco T75 e incube as células em um incubador a 37 °C, com 5% de dióxido de carbono (CO₂) por 20 h antes da transfeção.
   NOTA: Recomenda-se HEK293FT de baixo número de passagens (<20 passagens). Certifique-se de que a monocamada celular esteja 80-90% confluente.
2. Substitua o meio por 10 mL de meio completo fresco contendo cloroquina (100 µM) 2 h antes da transfeção.
3. Misture os reagentes e o DNA plasmidial conforme indicado na Tabela 2 e na Figura 1: ddH₂O (água bidestilada), pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ8.9, CaCl₂ 2,5 M (cloreto de cálcio) e tampão HEPES 2x 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico (HEPES). Pipete suavemente para cima e para baixo cinco vezes; incube a mistura à temperatura ambiente (RT) por 20 min.
4. Transfira a mistura para o meio acima das células e agite suavemente o frasco. Incube as células no incubador por 15 h.
5. Substitua o meio por 15 mL de meio DMEM completo fresco. Incube as células em um incubador a 37 °C, com 5% de CO₂, por 65 h.
   NOTA: A cor do meio será laranja claro ou levemente amarelada, e pelo menos 80% das células devem apresentar efeito citopático (CPE) ao microscópio invertido de luz.
6. Recolha o sobrenadante e centrifugue a 2095 x g por 20 min a 4 °C. Colete o sobrenadante, alíquota-o e armazene-o a -80 °C.

Tabela 1: Composição do meio DMEM completo.

Composição do meio DMEM completo	Concentração
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	1x
Soro bovino fetal	10%
Penicilina(1 U/mL)/Estreptomicina	1 μg/ mL

Tabela 2: Sistema de empacotamento de pseudovírus.

Materiais	Concentração	Volume
2x HEPES (pH 7.1)	--	675,0 μL
CaCl2 (2,5 M)	--	67,5 μL
ddH2O	--	529,2 μL
pCMV Δ 8,9	1000 ng/μL	18,9 μL
pCMV/R-HA	100 ng/μL	27,0 μL
pCMV/R-NA	50 ng/μL	13,5 μL
pHR-Luc	1000 ng/μL	18,9 μL

Resultados

Figura 1: Fluxograma da transfeção mediada por cálcio. Este fluxograma é usado para descrever os principais procedimentos da transfeção mediada por cálcio.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de cálcio anidro	AMRESCO	1B1110-500G	Reagente
Difosfato de cloroquina	Selleck	S4157	Reagente
Meio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM)	Gibco	12100-046	Reagente
Soro bovino fetal	Gibco	16000-044	Reagente
HEK293FT	Gibco	R700-07	Linha celular
ÁCIDO HEPES LIVRE	AMRESCO	0511-250G	Reagente
ELISA para antígeno p24 do HIV-1	ZeptoMetrix	801111	Kit de reagentes
Pacote de congelamento para sistema de ensaio de luciferase	Promega	E4530	Kit de reagentes
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	509-GRD-Q	material descartável
Tubos cónicos de centrífuga Nunc de 15 mL	Thermo Fisher Scientific	339650	material descartável
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140-122	Reagente
Pipetas (pontas de pipeta)10 μL)	Thermo Fisher Scientific	TF102-10-Q	material descartável
Pipetas (pontas de pipeta)100 μL)	Thermo Fisher Scientific	TF113-100-Q	material descartável
Pipetas (pontas de pipeta)1000 μL)	Thermo Fisher Scientific	TF112-1000-Q	material descartável
Pipetas serológicas (5 mL)	Thermo Fisher Scientific	170355N	material descartável
Pipetas serológicas (10 mL)	Thermo Fisher Scientific	170356N	material descartável