Silenciamento de MicroRNA Baseado no Vírus X da Batata em Plantas de Batata

Neste artigo

Resumo

Fonte: Zhao, J., et al. Silenciamento de microRNA Baseado no Vírus X da Batata (VbMS) em Batata. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra o uso de Agrobacterium tumefaciens para introduzir um construto baseado no Potato Virus X (PVX) em plantas de batata cultivadas in vitro para silenciamento de microRNA baseado em vírus (VbMS). O método permite a supressão sistêmica de um microRNA alvo, permitindo aos pesquisadores estudar seu papel no desenvolvimento da planta por meio de alterações fenotípicas observáveis.

Protocolo

1. Realizar o ensaio VbMS baseado em PVX em plantas de batata.

Transplante plantas de batata in vitro com 4 semanas de idade para o solo. As plantas transplantadas serão submetidas ao ensaio VbMS 3–4 dias depois.
Inocule plantas de batata com Agrobacterium contendo os plasmídeos PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic).
NOTA: Para o ensaio VbMS em batata, a infiltração mediada por Agrobacterium e a inoculação por arranhão com palito são realizadas simultaneamente.
1. Escolha e inocule transformantes positivos contendo vetores PVX-STTM em 50 mL de caldo LB líquido contendo 50 μg/mL de canamicina e 50 μg/mL de rifampicina. Incube em incubadora a 28 °C, a 220 rpm, por 16 h até atingir OD₆₀₀ = 1,0.
2. Ao mesmo tempo, estrie colônias positivas de Agrobacterium em pelo menos duas novas placas de LB contendo 50 μg/mL de canamicina e 50 μg/mL de rifampicina e incube a 28 °C por 1 dia. Inclua o vetor PVX-LIC como controle e o PVX-GFP para monitorar a disseminação do vírus.
3. Recolha a cultura líquida de Agrobacterium por centrifugação a 3.400 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Reuspenda as células de Agrobacterium com um volume igual de tampão de infiltração (10 mM MgCl₂, 10 mM MES e 200 µM acetosiringona, pH = 5,6) e ajuste para OD₆₀₀ = 1,0. Incube à temperatura ambiente por 6 h.
4. Infiltra a cultura de Agrobacterium no lado abaxial de folhas totalmente expandidas usando uma seringa de 1 mL sem agulha.
  1. Gire e segure uma folha com uma das mãos, depois use um dedo para apoiar a lâmina foliar do lado adaxial no local de infiltração. Mantenha a seringa perpendicular à superfície da folha com a outra mão e infiltre a cultura de Agrobacterium no lado abaxial da lâmina.
5. Retire a cultura de Agrobacterium das placas de LB e arranhe a superfície do caule dos primeiros um ou dois entrenós das plantas de batata infiltradas com um palito. Arranhe suavemente a epiderme do caule. Evite perfurar completamente o caule, o que pode causar danos graves às plantas.
Cultive as plantas infiltradas a 22 °C com um fotoperíodo de 16 h claro/8 h escuro e intensidade luminosa de 120 μmol/m²∙ s¹ em estufa.
NOTA: Fenótipos causados pelo silenciamento de miRNA geralmente aparecem entre 2–4 semanas após a inoculação (Figura 1, Figura 2). Normalmente leva de 10 a 20 dias para o fenótipo VbMS aparecer após a infiltração. O fenótipo VbMS depende das propriedades do miRNA específico e dos genes-alvo, das condições de crescimento e das variedades de batata.

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Resultados

Figura 1: VbMS do miR165/166 na variedade tetraploide de batata Katahdin. Fenótipos das plantas de batata (Katahdin) expressando o vetor controle PVX ou PVX-STTM165/166. Setas magenta indicam estruturas foliares ectópicas geradas nas nervur...