Preparação de Crioseções Retinianas de Camundongo para Avaliar a Permeabilidade Retiniana ao Vírus Adenoassociado

Resumo

Fonte: Vacca, O., et al. Uso do Vírus Associado a Adenovírus como Ferramenta para Estudar Barreiras Retinianas em Doenças. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o procedimento passo a passo para o preparo de crioseções da retina de camundongo, com o objetivo de visualizar a permeabilidade do vírus adeno-associado através de barreiras retinianas rompidas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram analisados e aprovados pelo comitê apropriado de ética em pesquisa com animais. 

1. Para cortes crioseccionados da retina (Figura 1), dissecar olhos eviscerados para remover a lente e a córnea, e fixar por imersão em paraformaldeído 4% durante 1 hr.
   1. Crioproteger os olhos previamente fixados em sacarose 10% durante 1 hr à temperatura ambiente, sacarose 20% por mais 1 hr à temperatura ambiente. Crioproteger em solução de sacarose 30%, durante a noite a 4 °C. Congelar e embutir as cúpulas oculares em resina de inclusão, como Cryo-matrix. Preparar cortes crioseccionados de 10 µm e montar em lâminas especialmente tratadas para seções de tecido congelado e que melhoram a aderência do tecido durante a coloração.
   2. Permeabilizar os cortes com Triton X-100 0,1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 durante 5 min. Lavar 2x em PBS e bloquear durante 1 hr à temperatura ambiente em PBS contendo albumina sérica bovina (BSA) 1%, Tween 20 0,1%.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática do protocolo geral. Após a produção do vírus adeno-associado (AAV), as partículas são injetadas no vítreo ou na veia peniana para anestesiar camundongos adultos. São realizadas imagens do fundo do olho com uma câmera Micron III para acompanhar a expressão da proteína verde fluorescente (GFP). O padrão de expressão da GFP é analisado em criocortes retinianos e retinas montadas em preparações planas graças à imunohistoquímica e imagens confocais. A passagem do AAV pela barreira hematorretiniana (BRB) é avaliada por meio de análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) em amostras de sangue provenientes de camundongos injetados intravítrea ou intraperitonealmente, com o objetivo de detectar a presença da sequência GFP, indicadora da presença das partículas de AAV na corrente sanguínea.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Resina de inclusão Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006
Lâminas adesivas Superfrost plus	Thermo Scientific	10143352
Lupa binocular SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0,66 x 5 x LEDs com suporte epi e dia / Dissecação de retinas
Tesoura de mola reta - 8,5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Dissecação retiniana