Preparação de Crioseções Retinianas de Camundongo para Avaliar a Permeabilidade Retiniana ao Vírus Adenoassociado

Neste artigo

Resumo

Fonte: Vacca, O., et al. Uso do Vírus Associado a Adenovírus como Ferramenta para Estudar Barreiras Retinianas em Doenças. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o procedimento passo a passo para o preparo de crioseções da retina de camundongo, com o objetivo de visualizar a permeabilidade do vírus adeno-associado através de barreiras retinianas rompidas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram analisados e aprovados pelo comitê apropriado de ética em pesquisa com animais.

Para cortes crioseccionados da retina (Figura 1), dissecar olhos eviscerados para remover a lente e a córnea, e fixar por imersão em paraformaldeído 4% durante 1 hr.
1. Crioproteger os olhos previamente fixados em sacarose 10% durante 1 hr à temperatura ambiente, sacarose 20% por mais 1 hr à temperatura ambiente. Crioproteger em solução de sacarose 30%, durante a noite a 4 °C. Congelar e embutir as cúpulas oculares em resina de inclusão, como Cryo-matrix. Preparar cortes crioseccionados de 10 µm e montar em lâminas especialmente tratadas para seções de tecido congelado e que melhoram a aderência do tecido durante a coloração.
2. Permeabilizar os cortes com Triton X-100 0,1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 durante 5 min. Lavar 2x em PBS e bloquear durante 1 hr à temperatura ambiente em PBS contendo albumina sérica bovina (BSA) 1%, Tween 20 0,1%.

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Resultados

Figura 1: Representação esquemática do protocolo geral. Após a produção do vírus adeno-associado (AAV), as partículas são injetadas no vítreo ou na veia peniana para anestesiar camundongos adultos. São realizadas imagens do fundo do olho com...