Entrega de Genes Mediada por AAV para Visualização do Comprometimento da Integridade da Membrana Retiniana

Resumo

Fonte: Vacca, O., et al. Utilização do Vírus Associado a Adenovírus como Ferramenta para Estudar as Barreiras Retinianas na Doença. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra o método de entrega gênica mediada por AAV na retina de camundongos transgênicos, seguido pelo dissecção do tecido e coloração para avaliar a integridade da membrana limitante interna.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê apropriado de ética em pesquisas com animais.

1. Imunohistoquímica

1. Para montagens planas da retina (Figura 1), fixe os olhos eviscerados em paraformaldeído a 4% durante 15 min para facilitar a dissecação.
   1. Em 15-30 min, dissecione os olhos para remover a córnea e a lente. Separe a retina do epitélio pigmentado da retina (RPE) e da esclera cortando ao redor da ora serrata e do nervo óptico. Mergulhe em paraformaldeído a 4% por mais 30 min para fixar a retina e a proteína fluorescente em células retinianas transduzidas (a fixação não deve exceder 24 h). Lave por 5 min em PBS estéril, pH 7,4.
   2. Substitua o tampão fosfato-salino (PBS) pelo tampão bloqueador (PBS com 1% de albúmina sérica bovina (BSA), 2% de soro normal de cabra ou burro, 0,5% de Triton X-100) e incube no tampão bloqueador por 4 h à temperatura ambiente ou à 4 °C durante a noite.
2. Incube os tecidos com anticorpos primários em tampão bloqueador por 4 h à temperatura ambiente ou à 4 °C durante a noite. Lave 3 vezes com PBS.
   NOTA: Os anticorpos utilizados são os seguintes: anti-laminina (1/1.000) para marcação da MLI (membranas limitantes internas), anti-rapsodopsina clone 4D2 (1/500) para marcação de bastonetes, anti-glutamina sintetase clone GS-6 (1/1.500) para marcação de células de Müller, lectina de aglutinina de amendoim (PNA) (1/40) para marcação de cones.
3. Incube os tecidos com diluição 1:500 de anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor em tampão bloqueador por 1 h (cortes criostáticos) ou 2 h (montagens planas) à temperatura ambiente e protegidos da luz. Lave 3 vezes com PBS.
4. Realize cortes aliviadores na retina e monte-a planamente sobre uma lâmina de vidro com o lado dos fotorreceptores ou das células ganglionares da retina (RGC) voltado para cima. Adicione meio aquoso de montagem, aplique a lamínula e armazene a 4 °C.
5. Realize microscopia confocal em um microscópio confocal de varredura a laser. Adquira imagens sequencialmente, linha por linha, para reduzir a interferência entre excitação e emissão. Defina o tamanho do passo de acordo com o teorema de amostragem de Nyquist-Shannon. Utilize configurações de exposição que minimizem os pixels sobrexpostos nas imagens finais. Processe imagens de 12 bits com FIJI, projete as secções Z em um único plano utilizando intensidade máxima na função Z-project e, por fim, converta para o modo de cor RGB de 8 bits.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática do protocolo geral. Após a produção do AAV, as partículas são injetadas no vítreo ou na veia peniana para anestesiar camundongos adultos. São realizadas imagens do fundo do olho com uma câmera Micron III para acompanhar a expressão da GFP (proteína verde fluorescente). O padrão de expressão da GFP é analisado em crioseções retinianas e retinas montadas em planificação por meio de imuno-histoquímica e imagens confocais. A passagem do AAV pela BHE (barreira hemato-retiniana) é avaliada por análise de PCR em amostras de sangue provenientes de camundongos injetados intravítreos ou intrapenianamente, com o objetivo de detectar a presença da sequência GFP, um indicador da presença de partículas de AAV na corrente sanguínea.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lâminas adesivas Superfrost Plus	Thermo Scientific	10143352	Lâminas
Anti-laminina	Sigma	L9393	Anticorpo
Anti-ródopsina clone 4D2	Millipore	MABN15	Anticorpo
Anti-glutamina sintetase clone GS-6	Millipore	MAB302	Anticorpo
Anti-Proteína Ácida Fibrilar de Células Gliais	Dako	334	Anticorpo
Lectina PNA	Invitrogen	L32459	Marcação
Anticorpos secundários conjugados com Alexa fluor	Invitrogen		Anticorpo
Reagente Fluorsave	Calbiochem	345789	Meio de montagem
Corante Azul de Evans	Sigma	E2129	Corante
Formamida espectrofotométrica	Sigma	295876-2L
Fluoresceína	Sigma	F2456	Corante
Micron III	Phoenix Research Labs		Sistema de microscopia baseado em câmera de cor 3-CCD, capturador de quadros e software comercial permite aos pesquisadores imagens das retinas de camundongos.
Lupa binocular SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0,66 x 5 x LEDs com suporte epi e dia / Dissecação de retinas
Tesoura de mola reta - 8,5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Dissecação retiniana