Entrega de Genes Mediada por AAV para Visualização do Comprometimento da Integridade da Membrana Retiniana

Neste artigo

Resumo

Fonte: Vacca, O., et al. Utilização do Vírus Associado a Adenovírus como Ferramenta para Estudar as Barreiras Retinianas na Doença. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra o método de entrega gênica mediada por AAV na retina de camundongos transgênicos, seguido pelo dissecção do tecido e coloração para avaliar a integridade da membrana limitante interna.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê apropriado de ética em pesquisas com animais.

1. Imunohistoquímica

Para montagens planas da retina (Figura 1), fixe os olhos eviscerados em paraformaldeído a 4% durante 15 min para facilitar a dissecação.
1. Em 15-30 min, dissecione os olhos para remover a córnea e a lente. Separe a retina do epitélio pigmentado da retina (RPE) e da esclera cortando ao redor da ora serrata e do nervo óptico. Mergulhe em paraformaldeído a 4% por mais 30 min para fixar a retina e a proteína fluorescente em células retinianas transduzidas (a fixação não deve exceder 24 h). Lave por 5 min em PBS estéril, pH 7,4.
2. Substitua o tampão fosfato-salino (PBS) pelo tampão bloqueador (PBS com 1% de albúmina sérica bovina (BSA), 2% de soro normal de cabra ou burro, 0,5% de Triton X-100) e incube no tampão bloqueador por 4 h à temperatura ambiente ou à 4 °C durante a noite.
Incube os tecidos com anticorpos primários em tampão bloqueador por 4 h à temperatura ambiente ou à 4 °C durante a noite. Lave 3 vezes com PBS.
NOTA: Os anticorpos utilizados são os seguintes: anti-laminina (1/1.000) para marcação da MLI (membranas limitantes internas), anti-rapsodopsina clone 4D2 (1/500) para marcação de bastonetes, anti-glutamina sintetase clone GS-6 (1/1.500) para marcação de células de Müller, lectina de aglutinina de amendoim (PNA) (1/40) para marcação de cones.
Incube os tecidos com diluição 1:500 de anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor em tampão bloqueador por 1 h (cortes criostáticos) ou 2 h (montagens planas) à temperatura ambiente e protegidos da luz. Lave 3 vezes com PBS.
Realize cortes aliviadores na retina e monte-a planamente sobre uma lâmina de vidro com o lado dos fotorreceptores ou das células ganglionares da retina (RGC) voltado para cima. Adicione meio aquoso de montagem, aplique a lamínula e armazene a 4 °C.
Realize microscopia confocal em um microscópio confocal de varredura a laser. Adquira imagens sequencialmente, linha por linha, para reduzir a interferência entre excitação e emissão. Defina o tamanho do passo de acordo com o teorema de amostragem de Nyquist-Shannon. Utilize configurações de exposição que minimizem os pixels sobrexpostos nas imagens finais. Processe imagens de 12 bits com FIJI, projete as secções Z em um único plano utilizando intensidade máxima na função Z-project e, por fim, converta para o modo de cor RGB de 8 bits.

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Resultados

Figura 1: Representação esquemática do protocolo geral. Após a produção do AAV, as partículas são injetadas no vítreo ou na veia peniana para anestesiar camundongos adultos. São realizadas imagens do fundo do olho com uma câmera Micron III p...