Este vídeo demonstra a produção e purificação de partículas recombinantes do vírus da hepatite B, permitindo preparações virais seguras e com deficiência de replicação para o estudo de eventos iniciais de infecção e para aplicações de triagem em larga escala de fármacos antivirais.
Artigo de método
Produção e Purificação de Partículas do Vírus da Hepatite B Recombinante
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31 de agosto de 2026
Neste artigo
Resumo
Protocolo
1. Produção do HBV Recombinante (Vírus da Hepatite B) que Codifica a Proteína Repórter
- Preparação de células HepG2
- Prepare o meio de cultura celular (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina e 100 U/ml de aminoácidos não essenciais).
- Plaque 4 x 106 células HepG2 (carcinoma hepatocelular humano G2) em uma placa de 10 cm revestida com colágeno em 10 ml de meio de cultura no dia anterior à transfeção. Incube as células HepG2 a 37 °C em uma estufa úmida com 5% de CO2.
NOTA: Quando aproximadamente 4 x 106 células HepG2 são semeadas em uma placa de 10 cm revestida com colágeno em 10 ml de meio de cultura, elas atingirão 70-90% de confluência no dia seguinte.
- Transfeção
- Transfete as células HepG2 com 5 µg do plasmídeo pUC1.2HBV delta epsilon15 (um plasmídeo de replicação do HBV com deleção na sequência épsilon) e 5 µg do pUC1.2HBV/NL15 utilizando um reagente de transfeção conforme instruções do fabricante.
- No dia seguinte, remova o meio de cultura e adicione 10 ml de meio de cultura fresco.
- Uma semana após a transfeção, transfira o meio de cultura contendo o HBV recombinante para um tubo de 50 ml e prossiga para o passo 1.3.1. Adicione 10 ml de meio de cultura fresco à placa contendo as células transfectadas.
NOTA: A produção do HBV recombinante é mantida por 4 semanas. O meio de cultura contendo o HBV recombinante pode ser armazenado a 4 °C por 1 mês.
- Purificação do HBV recombinante
- Remova os detritos celulares do meio de cultura contendo o HBV recombinante por centrifugação (2.300 x g durante 5 min).
- Passe o sobrenadante por um filtro de membrana de 0,45 µm.
- Adicione um volume igual de PEG 26% / NaCl 1,5 M (polietilenoglicol 6000: 130 g, NaCl (cloreto de sódio), 49 g, 1 ml de EDTA 0,5 M (ácido etilenodiaminotetraacético) pH 8,0 e 5 ml de HEPES 1 M (N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfônico) pH 7,6 em 500 ml) ao meio de cultura contendo o HBV recombinante e misture suavemente. Incube durante a noite a 4 °C.
- Centrifugue a 2.300 x g por 20 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante e dissolva o pellet em 0,5 ml de TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
- Remova os detritos por centrifugação a 2.300 x g por 5 min.
- Carregue 0,5 ml de TNE contendo o HBV recombinante sobre 0,8 ml de sacarose a 20% em TNE.
- Centrifugue a 100.000 × g por 3 h a 15 °C.
- Descarte o máximo possível do sobrenadante e conserve o pellet. Re-suspenda-o em 1 ml de DMEM sem soro por cada 40 ml de meio de cultura inicial.
- Incube durante a noite a 4 °C.
- Filtre por um filtro de 0,45 µm. Prepare alíquotas de 0,5 ml e armazene a -80 °C.
NOTA: Se for observada contaminação por proteína repórter na amostra original do vírus, purifique o vírus por ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose 5-30% em TNE a 100.000 x g por 2 h, ou por centrifugação em equilíbrio de densidade com CsCl (cloreto de césio) de 1,1-1,6 g/ml a 150.000 x g por 50 h.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Reagente do Ensaio de Luciferase Nano-Glo | Promega | N1110 | ||
| Solução mista de Penicilina-Estreptomicina | Nacalai tesque | 09367-34 | ||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | ||
| Prato revestido com colágeno de 100 mm | Iwaki | 4020-010 | ||
| Reagente de Transfecção Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | ||
| Polietilenoglicol (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | ||
| Polietilenoglicol (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | ||
| NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | ||
| Solução de EDTA 0,5 mol/L | Nacalai tesque | 06894-14 | ||
| Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | ||
| Millex-HP, filtro de poliéter sulfona de 0,45 μm | Merck Millipore | SLHP033RS | ||
| Dissulfóxido de dimetila (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | ||
| Placa de 96 poços revestida com colágeno | Corning | NO3585 | ||
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | - | - | ||
| pUC1.2HBV delta epsilon | - | - | ||
| pUC1.2HBV/NL | - | - |
