Produção e Purificação de Partículas do Vírus da Hepatite B Recombinante

Resumo

Fonte: Nishitsuji, H., et al. Desenvolvimento de um Sistema Repórter do Vírus da Hepatite B para Monitorar os Estágios Iniciais do Ciclo de Replicação. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a produção e purificação de partículas recombinantes do vírus da hepatite B, permitindo preparações virais seguras e com deficiência de replicação para o estudo de eventos iniciais de infecção e para aplicações de triagem em larga escala de fármacos antivirais.

Protocolo

1. Produção do HBV Recombinante (Vírus da Hepatite B) que Codifica a Proteína Repórter

1. Preparação de células HepG2
   1. Prepare o meio de cultura celular (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina e 100 U/ml de aminoácidos não essenciais).
   2. Plaque 4 x 10⁶ células HepG2 (carcinoma hepatocelular humano G2) em uma placa de 10 cm revestida com colágeno em 10 ml de meio de cultura no dia anterior à transfeção. Incube as células HepG2 a 37 °C em uma estufa úmida com 5% de CO₂.
      NOTA: Quando aproximadamente 4 x 10⁶ células HepG2 são semeadas em uma placa de 10 cm revestida com colágeno em 10 ml de meio de cultura, elas atingirão 70-90% de confluência no dia seguinte.
2. Transfeção
   1. Transfete as células HepG2 com 5 µg do plasmídeo pUC1.2HBV delta epsilon15 (um plasmídeo de replicação do HBV com deleção na sequência épsilon) e 5 µg do pUC1.2HBV/NL15 utilizando um reagente de transfeção conforme instruções do fabricante.
   2. No dia seguinte, remova o meio de cultura e adicione 10 ml de meio de cultura fresco.
   3. Uma semana após a transfeção, transfira o meio de cultura contendo o HBV recombinante para um tubo de 50 ml e prossiga para o passo 1.3.1. Adicione 10 ml de meio de cultura fresco à placa contendo as células transfectadas.
      NOTA: A produção do HBV recombinante é mantida por 4 semanas. O meio de cultura contendo o HBV recombinante pode ser armazenado a 4 °C por 1 mês.
3. Purificação do HBV recombinante
   1. Remova os detritos celulares do meio de cultura contendo o HBV recombinante por centrifugação (2.300 x g durante 5 min).
   2. Passe o sobrenadante por um filtro de membrana de 0,45 µm.
   3. Adicione um volume igual de PEG 26% / NaCl 1,5 M (polietilenoglicol 6000: 130 g, NaCl (cloreto de sódio), 49 g, 1 ml de EDTA 0,5 M (ácido etilenodiaminotetraacético) pH 8,0 e 5 ml de HEPES 1 M (N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfônico) pH 7,6 em 500 ml) ao meio de cultura contendo o HBV recombinante e misture suavemente. Incube durante a noite a 4 °C.
   4. Centrifugue a 2.300 x g por 20 min a 4 °C.
   5. Descarte o sobrenadante e dissolva o pellet em 0,5 ml de TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
   6. Remova os detritos por centrifugação a 2.300 x g por 5 min.
   7. Carregue 0,5 ml de TNE contendo o HBV recombinante sobre 0,8 ml de sacarose a 20% em TNE.
   8. Centrifugue a 100.000 × g por 3 h a 15 °C.
   9. Descarte o máximo possível do sobrenadante e conserve o pellet. Re-suspenda-o em 1 ml de DMEM sem soro por cada 40 ml de meio de cultura inicial.
   10. Incube durante a noite a 4 °C.
   11. Filtre por um filtro de 0,45 µm. Prepare alíquotas de 0,5 ml e armazene a -80 °C.
       NOTA: Se for observada contaminação por proteína repórter na amostra original do vírus, purifique o vírus por ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose 5-30% em TNE a 100.000 x g por 2 h, ou por centrifugação em equilíbrio de densidade com CsCl (cloreto de césio) de 1,1-1,6 g/ml a 150.000 x g por 50 h.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente do Ensaio de Luciferase Nano-Glo	Promega	N1110
Solução mista de Penicilina-Estreptomicina	Nacalai tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Prato revestido com colágeno de 100 mm	Iwaki	4020-010
Reagente de Transfecção Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polietilenoglicol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polietilenoglicol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
Solução de EDTA 0,5 mol/L	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, filtro de poliéter sulfona de 0,45 μm	Merck Millipore	SLHP033RS
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Placa de 96 poços revestida com colágeno	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-