1. Transdução de Mosquitos<ol><li>Lave 100 larvas de primeiro estágio de Aedes albopictus três vezes usando água desionizada e, em seguida, transfira as larvas para um béquer contendo 95 mL de água desionizada. Adicione 5 mL dos estoques do densovírus recombinante de Aedes aegypti (rAaeDV) (concentração final de 1,00 x 1010 cópias/mL).</li><li>Incube por 24 h a 28 °C, lave as larvas três vezes usando água desionizada e, então, transfira novamente as larvas para as placas e alimente regularmente.</li><li>Monitore o nível de expressão do gene alvo nas larvas por qPCR ou Western blot. NOTA: O método de detecção de sinal fluorescente pode ser usado para isolar as larvas infectadas com maior precisão. Por exemplo, para detectar sinais fluorescentes em larvas infectadas com o vírus recombinante que expressa DsRed, as larvas podem ser colocadas em uma lâmina de concavidade e observadas em um microscópio de fluorescência invertido a cada 8 h até 2 dias pós-infecção. Assim que larvas fluorescentes forem detectadas, devem ser separadas em copos plásticos individuais para permitir observação contínua subsequente. Larvas com múltiplos tecidos infectados podem ser identificadas utilizando este método.</li></ol>

<table class="ck-table-resized"><tbody><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td>&#xA0;</td></tr><tr><td>Sistema de centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td>&#xA0;</td></tr><tr><td>SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)</td><td>Beijing Tiangen Biotech</td><td>FP205</td><td>&#xA0;</td></tr></tbody></table>

silenciamento gênico mediado por densovírus recombinante em larvas de mosquito

Recombinant Densovirus-Mediated Gene Silencing in Mosquito Larvae

Fonte: <a href="https://app.jove.com/v/56121/use-recombinant-mosquito-densovirus-as-gene-delivery-vector-for">Liu, P., et al. Uso de um Densovírus Recombinante de Mosquito como Vetor de Entrega Gênica para a Análise Funcional de Genes em Larvas de Mosquito. J. Vis. Exp. (2017)</a>Este vídeo demonstra o uso de densovírus recombinantes de mosquito que codificam microRNAs para silenciar genes específicos em larvas de mosquito. Larvas infectadas em estágios iniciais produzem microRNAs funcionais que suprimem a expressão do gene-alvo para estudos posteriores.

Silenciamento Gênico Mediado por Densovírus Recombinante em Larvas de Mosquito

https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/24583/24583_article_thumb_24583.jpg

Utilize larvas de mosquito de estágio inicial, que são suscetíveis à infecção viral.Transfira as larvas para um béquer contendo água deionizada.Introduza o densovírus recombinante, modificado para codificar um microRNA que suprime genes larvais-alvo. Incube.As larvas absorvem o vírus, que então atinge o intestino.O vírus ingerido atravessa o epitélio intestinal e se espalha para outros tecidos.O vírus entra nas células larvais por endocitose e libera seu DNA no núcleo.O DNA viral produz microRNAs.No citoplasma, esses microRNAs se ligam ao complexo de silenciamento induzido por RNA.O complexo se liga e cliva os RNAm larvais complementares alvo, impedindo a expressão e levando ao silenciamento gênico.Após a incubação, lave as larvas com água deionizada para remover partículas virais não ingeridas.Transfira as larvas para uma placa nova com alimento para recuperação.As larvas de mosquito infectadas pelo vírus, com o gene-alvo silenciado, estão prontas para aplicações posteriores.Lave 100 larvas de primeiro estágio de A. albopictus três vezes, utilizando água desionizada. Em seguida, transfira as larvas para um béquer contendo 95 mililitros de água desionizada.Adicione cinco mililitros

recombinant-densovirus-mediated-gene-silencing-in-mosquito-larvae

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiology

Microbiologia

Viral Growth and Techniques

Crescimento Viral e Técnicas

Viral Engineering & Vector Development

Engenharia Viral e Desenvolvimento de Vetores

10 visualizações. Take early-instar mosquito larvae, which are susceptible to viral infection.Transfer the larvae to a beaker containing deionized water.Introduce recombinant densovirus, engineered to encode a microRNA that suppresses target larval genes. Incubate.The larvae take up the virus, which then reaches the gut.The ingested virus crosses the gut epithelium and spreads to other tissues.The virus enters larval cells via endocytosis and releases its DNA into the nucleus...

Silenciamento Gênico Mediado por Densovírus Recombinante em Larvas de Mosquito

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Nome	Empresa	Número de catálogo
Centrífuga	Thermo Scientific	75004260
Sistema de centrífuga	Beckman Coulter	363118
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	Beijing Tiangen Biotech	FP205