Silenciamento Gênico Mediado por Densovírus Recombinante em Larvas de Mosquito

Resumo

Fonte: Liu, P., et al. Uso de um Densovírus Recombinante de Mosquito como Vetor de Entrega Gênica para a Análise Funcional de Genes em Larvas de Mosquito. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o uso de densovírus recombinantes de mosquito que codificam microRNAs para silenciar genes específicos em larvas de mosquito. Larvas infectadas em estágios iniciais produzem microRNAs funcionais que suprimem a expressão do gene-alvo para estudos posteriores.

Protocolo

1. Transdução de Mosquitos

1. Lave 100 larvas de primeiro estágio de Aedes albopictus três vezes usando água desionizada e, em seguida, transfira as larvas para um béquer contendo 95 mL de água desionizada. Adicione 5 mL dos estoques do densovírus recombinante de Aedes aegypti (rAaeDV) (concentração final de 1,00 x 10¹⁰ cópias/mL).
2. Incube por 24 h a 28 °C, lave as larvas três vezes usando água desionizada e, então, transfira novamente as larvas para as placas e alimente regularmente.
3. Monitore o nível de expressão do gene alvo nas larvas por qPCR ou Western blot.
   NOTA: O método de detecção de sinal fluorescente pode ser usado para isolar as larvas infectadas com maior precisão. Por exemplo, para detectar sinais fluorescentes em larvas infectadas com o vírus recombinante que expressa DsRed, as larvas podem ser colocadas em uma lâmina de concavidade e observadas em um microscópio de fluorescência invertido a cada 8 h até 2 dias pós-infecção. Assim que larvas fluorescentes forem detectadas, devem ser separadas em copos plásticos individuais para permitir observação contínua subsequente. Larvas com múltiplos tecidos infectados podem ser identificadas utilizando este método.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Centrífuga	Thermo Scientific	75004260
Sistema de centrífuga	Beckman Coulter	363118
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	Beijing Tiangen Biotech	FP205