Visualização de Capsídeos Virais Tratados Termicamente Utilizando Microscopia Eletrônica de Transmissão

Resumo

Fonte: Moore, M. D., et al. Métodos Alternativos In Vitro para a Determinação da Integridade Estrutural de Capsídeos Virais. J. Vis. Exp.(2017).

Este vídeo demonstra como capsídeos virais purificados são submetidos a tratamento térmico, preparados e visualizados utilizando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para revelar alterações estruturais e danos induzidos pelo calor.

Protocolo

1. Preparação da amostra para MET
   1. Obtenha grades com filme de suporte de carbono (níquel) projetadas para MET.
      NOTA: Consulte a instalação central sobre reagentes recomendados e seu manuseio para uso com o microscópio da instalação. Certifique-se de armazenar as grades em uma caixa contendo dessecante ou em uma câmara a vácuo para minimizar a exposição à umidade.
   2. Recorte pedaços de papel-filtro de aproximadamente 5 cm x 5 cm. Obtenha placas de Petri de vidro e pinças reversas autotravantes apropriadas para uso em microscopia.
   3. Corte um pedaço de filme de parafina de aproximadamente 2,5 cm x 5 cm. Coloque sobre a bancada.
   4. Tratamento térmico de capsídeos do norovírus GII.4 Sydney
      1. Obtenha a proteína principal do capsídeo do norovírus humano purificado (VP1) do GII.4 Sydney (Acesso: JX459908) montado em capsídeos. 
         NOTA: Os capsídeos no estudo foram obtidos gentilmente cedidos por R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
      2. Dilua os capsídeos em ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico (HEPES) 10 mM (pH 7,4) até um volume máximo de 15 µL em tubos individuais de reação em cadeia da polimerase (PCR) com tampa. Certifique-se de que o tubo contenha pelo menos 600 ng de capsídeo. Garanta que haja 600 ng de capsídeo por combinação tratamento-ligante.
      3. Pré-aqueça o termociclador à temperatura desejada de tratamento térmico. 
         NOTA: Para este protocolo, escolheu-se o tratamento a 68 °C por diferentes tempos (0 - 25 min).
      4. Pré-aqueça um termociclador adicional a 4 °C para resfriamento imediato. Adicione os tubos com a solução de capsídeo ao termociclador pelo tempo desejado. Transfira imediatamente para um termociclador pré-resfriado a 4 °C por 5 min após o aquecimento.
      5. Centrifugue brevemente para levar todas as gotas para o fundo do tubo.
      6. Pipete toda a gota de ~15 µL da solução de capsídeo tratada sobre o filme de parafina.
   5. Segure a borda da grade com pinças, permitindo que fechem sobre a borda para segurar a grade, e posicione a grade com o lado de carbono voltado para baixo sobre a gota da solução tratada. Deixe incubando por 10 min para permitir que o capsídeo se ligue à grade.
      1. Dependendo da pureza da preparação do capsídeo, adicione lavagens com a solução de HEPES 10 mM, se necessário, na forma de gotas de 10-15 µL colocadas em sequência após a gota de capsídeo tratado.
      2. Após 10 min, levante a grade com a gota. Posicione a grade quase perpendicularmente a um pedaço de papel-filtro para absorver a gota. Levante a gota de tampão HEPES de 10 - 15 µL com a grade, mantenha por 30 s, depois absorva com outro pedaço de papel-filtro para lavar.
   6. Coloque uma gota de 15 µL de solução de acetato de uranila 2% sobre o filme de parafina em uma área vazia.
      1. Levante a gota de acetato de uranila com a grade e mantenha por 45 s. Absorva o acetato de uranila, certificando-se de remover a maior parte da solução. Coloque a grade com o lado de carbono voltado para cima sobre um pedaço de papel-filtro, tomando cuidado para que a grade não fique "grudada" na umidade das pinças. Coloque o papel-filtro com a grade sobre ele em uma placa de Petri de vidro aberta.
         NOTA: Não use placas de Petri de plástico, pois as grades serão eletrostaticamente atraídas por elas e ficarão presas ao recipiente.
   7. Repita para todos os tratamentos. Coloque as metades das placas de Petri com as grades em um dessecador durante a noite para secagem antes da observação ao MET.
   8. Consulte a instalação de microscopia da instituição respectiva sobre a observação das grades preparadas. Algumas instalações permitem que o usuário seja treinado no uso do equipamento da instalação. Detalhes específicos sobre a configuração e observação de um microscópio específico estão além do escopo deste artigo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Preparação da amostra para microscopia eletrônica de transmissão
Grades de microscopia eletrônica de níquel com filme de suporte de carbono	Ladd Research	10880-100
Pinzas reversas autotravantes para microscopia eletrônica	Ted Pella	5372-NM
Papel filtro qualitativo	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Placas de Petri de vidro	Sigma-Aldrich	BR455743
Solução estoque de HEPES 100 mM (pH 7,2)	N/A	N/A
Acetato de uranila 2%	N/A	N/A