Entrega de Genes Mediada por Bacteriófagos em Bactérias Espiroquetas

Resumo

Fonte: Eggers, C. H. Manipulação Genética Mediada por Fagos do Espiroqueta da Doença de Lyme Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra a transdução de espiroquetas Borrelia geneticamente modificadas utilizando bacteriófagos não infecciosos, precipitados com polietileno glicol, que carregam um plasmídeo de resistência à canamicina. Após a incubação com as bactérias, o cultivo é repicado em meio suplementado com antibiótico. Apenas as células que recebem o plasmídeo sobrevivem e formam colônias. Essas colônias são então selecionadas e ampliadas em meio líquido contendo antibiótico para estabelecer uma população bacteriana estável portadora do plasmídeo, destinada a aplicações posteriores

Protocolo

1. Ensaio de transdução após a precipitação com PEG (polietilenoglicol) do bacteriófago φBB-1

1. Preparar B. burgdorferi culturas a serem usadas como receptor em ensaios de transdução. Com base na densidade determinada, calcule o volume de cultura do receptor necessário para obter 15 mL de 1 × 107 espiroquetas·mL−1
2. Centrifugue o volume da cultura a 6.000 x g durante 10 min. Decante o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 14,5 mL de BSK (Barbour-Stoenner-Kelly) fresco.
3. Adicione ≤500 µL de amostra de fago precipitado com PEG à cultura do clone receptor. Misture bem e incube a 33 °C por 72-96 h.
   OBSERVAÇÃO: A quantidade de fago recuperada durante a precipitação com PEG pode variar, dependendo de diversos fatores. No entanto, a partir de um cultivo de 15 mL do indutor B. burgdorferi linhagem CA-11.2A, 500 µL geralmente contém 50 a 1.000 fagos viáveis²⁸. Volumes de recuperação de fagos ≥500 µL afetar negativamente B. burgdorferi crescimento, provavelmente devido à maior proporção de SM (Meio de Suspensão) em relação ao BSK.
4. Realize a seleção de transdutantes por plaqueamento em fase sólida após a mistura com fago precipitado com PEG.

2. Seleção de transduzidos

NOTA: O plaqueamento em fase sólida de possíveis transduzidos é realizado usando uma modificação em camada única do protocolo. As colônias de B. burgdorferi crescem dentro do ágar, portanto, para a seleção de transduzidos por plaqueamento em fase sólida, as amostras devem ser adicionadas ao meio enquanto as placas estão sendo preparadas. Esta técnica também pode ser eficaz para a seleção de transduzidos, mas ainda não foi testada para esse fim.

1. Determine o número de placas necessárias para a seleção de transduzidos com base no número de amostras dos ensaios de transdução e controles a serem semeados.
   NOTA: Normalmente, são preparadas duas placas por amostra, uma equivalente a aproximadamente 10% do volume da cultura e outra que inclui o restante da cultura. Além disso, prepare placas que servirão como controles negativos para testar individualmente se a preparação de fagos e/ou os clones parentais usados como doador e receptor não crescem na presença do(s) antibiótico(s) utilizado(s) durante a seleção. Também é recomendado preparar material para pelo menos duas placas extras. Por exemplo, se o número de amostras e controles a serem semeados for oito, prepare material suficiente para 10 placas.
2. Prepare as soluções para semeadura conforme descrito abaixo.
   NOTA: Cada placa terá 30 mL, constituídos por 20 mL de BSK 1,5x para semeadura e 10 mL de agarose a 2,1% (proporção 2:1). Isso resultará em uma placa com concentrações finais de BSK 1x e agarose 0,7%. Por exemplo, para 10 placas, prepare uma mistura total de semeadura de 300 mL, composta por 200 mL de BSK 1,5x e 100 mL de agarose a 2,1%.
   1. Prepare 1 L de BSK 1,5x utilizando as quantidades de cada componente listadas para BSK 1,5x. Armazene conforme descrito para BSK 1x.
   2. Prepare agarose a 2,1% em água e autoclave. Use a solução de agarose fresca ou armazene à temperatura ambiente. Se armazenada à temperatura ambiente, aqueça em banho-maria com a tampa solta até completa fusão antes da semeadura.
   3. Determine o volume do(s) antibiótico(s) necessário para atingir a concentração apropriada com base na mistura total de semeadura.
      NOTA: Se o volume total da solução final de semeadura for 300 mL, misture 200 mL de BSK 1,5x e quantidade suficiente de antibiótico para garantir que os 300 mL tenham a concentração final correta de antibiótico. Se o doador e o receptor no ensaio de transdução tiverem genes diferentes de resistência a antibióticos, a mistura de semeadura deve conter ambos os antibióticos. Se o fago precipitado com PEG do doador codificar um marcador de resistência a antibiótico e o receptor não tiver nenhum, a mistura de semeadura deve conter apenas o antibiótico.
3. Com base no número de placas a serem preparadas, transfira a quantidade apropriada de BSK 1,5x e antibiótico(s) para um frasco estéril de tamanho suficiente para conter toda a mistura de semeadura. Equilibre em banho-maria a 56 °C por ≥15 min.
4. Equilibre a agarose fundida proveniente do autoclave ou do micro-ondas em banho-maria a 56 °C por ≥15 min.
5. Após a equilibração, adicione a quantidade determinada de agarose a 2,1% ao frasco com BSK 1,5x (com antibiótico) e retorne a solução de semeadura ao banho-maria a 42 °C por 10-15 min.
   NOTA: Temperaturas mais altas podem danificar ou matar os espiroquetas36. Se estiver usando o mesmo banho-maria acima, resfrie-o para 42-45 °C antes de iniciar o cronômetro para a equilibração. Não deixe a solução de semeadura equilibrar a 42 °C por mais de 20 min, pois começará a solidificar durante o preparo das placas.
6. Durante a equilibração, prepare as amostras de B. burgdorferi a serem semeadas. Transfira a quantidade a ser semeada para um tubo cônico estéril de centrífuga de 50 mL.
7. Se for semear um volume menor que 1,5 mL (<5% do volume final da placa de 30 mL), transfira a amostra para o novo tubo e adicione a mistura de semeadura diretamente à amostra durante a semeadura.
   1. Para volumes maiores, transfira o volume desejado da cultura para o novo tubo e, em seguida, centrifugue a 6.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. Remova todo o sobrenadante, exceto 100-500 µL, e use o restante para ressuspender completamente o pellet antes da semeadura.
   2. Para placas de controle após cocultivo, adicione ≥107 células dos clones doadores ou receptores a tubos cónicos estéreis de 50 mL. Se o volume for superior a 1,5 mL, centrifugue e ressuspenda o pellet. Se um ensaio de transdução foi realizado utilizando o fago precipitado com PEG, adicione, além do clone receptor, 100-250 µL da amostra de fago a um tubo cónico estéril de 50 mL para semeadura.
8. Após a solução de semeadura ter equilibrado a 42-45 °C por 10-15 min, transfira 30 mL da solução de semeadura para um tubo com a amostra apropriada; dispense imediatamente a mistura de semeadura e a amostra em uma placa identificada. Repita com uma pipeta nova para cada amostra a ser semeada.
9. Deixe as placas solidificarem por 15-20 min e, em seguida, coloque-as em um incubador a 33 °C suplementado com 5% de CO₂. Não inverta as placas por pelo menos 48 h após o preparo.
10. Dependendo do background do clone receptor, verifique se as colônias aparecem dentro da agarose nas placas de seleção após 10-21 dias de incubação. Escolha pelo menos 5-10 colônias que cresceram na placa na presença de ambos os antibióticos, utilizando uma pipeta de borossilicato esterilizada de 5,75 polegadas com tampa de algodão, e inocule-as em 1,5 mL de BSK 1x com o(s) antibiótico(s) apropriado(s).
11. Cultive as colônias inoculadas a 33 °C por 3-5 dias ou até atingirem uma densidade de aproximadamente 20-40 espiroquetas por campo em 200x de aumento usando microscopia de campo escuro.
    NOTA: Após a triagem, os espiroquetas podem ser congelados para armazenamento de longo prazo a −80 °C, misturando um volume igual de cultura com uma mistura de 60% de glicerol e 40% de BSK 1x esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 µm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos cônicos de centrífuga de 15 mL (polipropileno)	USA Scientific	5618-8271
Mitomicina C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	ATENÇÃO: possível carcinógeno; usar somente em capela de exaustão química
Pipetas de Pasteur 5,75" (com tampão de algodão/vidro borossilicato/não estéril)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	Esterilizar em autoclave antes do uso
Tubos cônicos de centrífuga de 50 mL (polipropileno)	USA Scientific	1500-1211
Etanol absoluto
Eritromicina	Research Products International Corp	E57000-25.0
Solução estoque de gentamicina	Gibco	15750-060
Glicose (Dextrose anidra)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Sulfato de canamicina	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0