Entrega de Genes em Organoides Intestinais de Camundongo Utilizando Vetores Lentivirais

Resumo

Fonte: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocolo para Transdução com Lentivírus e Análise Subsequente de Organoides Intestinais. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo descreve a transdução lentiviral de organoides intestinais de camundongo a partir de uma estrutura semelhante a criptas contendo suspensão. Utilizando uma matriz de membrana basal como suporte e meios suplementados com fatores de crescimento, vetores lentivirais são introduzidos para permitir a integração estável de genes

Protocolo

Transdução de Lentivírus em Organoides

Dia 0:

1. Divida um poço completo de 0,95 cm² de organoides dois dias antes da transdução em um novo poço, visando obter aproximadamente 50 organoides pequenos. Divida os organoides (Figura 1A, B).
2. Suplemente o meio de cultura de organoides com 10 µM de Chir99021 e 10 mM de nicotinamida para obter criptas císticas hiperproliferativas (Figura 1C).
   NOTA: As criptas císticas desenvolvem-se melhor quando organoides recém-divididos são cultivados na presença de Chir99021.

Dia 2:

3. Colete os organoides pipetando para cima e para baixo a mistura de matrigel e meio, perturbando-a com uma micropipeta p1000. Coloque a mistura em um tubo de 15 mL.
4. Perturbe ainda mais usando uma pipeta de Pasteur cuja abertura distal tenha sido reduzida por fusão. Centrifugue os organoides para formar um pellet durante 5 min a 100 x g.
   NOTA: Dependendo do tamanho da centrífuga, utilize uma velocidade diferente. É necessário encontrar a velocidade exata na qual os organoides perturbados se separam da mistura.
5. Remova o sobrenadante e adicione 500 µL de tripsina 1x pré-aquecida (semelhante à tripsina 0,25%). Re-suspenda os organoides na tripsina e incube por 3 min em banho-maria a 37 °C.
6. Inative a tripsina adicionando 3,5 mL de meio de cultura para linhagem celular [Meio Essencial Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina e glutamina]. Centrifugue por 5 min a 500 x g.
7. Remova o sobrenadante, deixando um pellet em aproximadamente 20 µL de meio. Transfira os organoides nesta pequena quantidade residual de meio para um poço de uma placa de 48 poços.
8. Adicione lentivírus de alto título no meio de transdução, re-suspenda e prossiga para o passo 3.10. Quando houver baixa eficácia de transdução.
   NOTA: Para transdução eficiente, normalmente adicione uma alíquota de 250 µL de lentivírus de alto título a um poço de organoides. Isso representa 50% de todo o lentivírus colhido a partir de uma única produção.
9. Opcionalmente: para aumentar a eficácia da transdução, realize a spinoculação colocando a placa de 48 poços contendo os organoides em uma centrífuga pré-aquecida a 32 °C e gire a 600 x g por 1 hr.
10. Coloque a mistura de organoides e vírus na incubadora de cultura e incube por 1 hr a 37 °C na incubadora de cultura para permitir a transdução.
11. Opcionalmente: para aumentar ainda mais a eficácia da transdução, incube os organoides por mais 3 hr adicionais a 37 °C na incubadora de cultura.
12. Adicione 1 mL de meio de cultura de organoides e re-suspenda a mistura de organoides e vírus, transfira para um tubo de microcentrífuga e centrifugue em microcentrífuga por 5 min a 850 x g para formar um pellet de organoides.
13. Remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 20 µL de Matrigel gelado. Como o material se solidifica ao aquecer, use ponteiras resfriadas pipetando várias vezes para cima e para baixo com PBS gelado.
14. Coloque a gota no centro de um poço de uma placa de 48 poços e incube na incubadora de cultura a 37 °C por 15 min para solidificar.
15. Após 15 min, adicione cuidadosamente 250 µL de meio de cultura de organoides suplementado com 10 mM nicotinamida, 10 µM Chir99021 e 10 µM Y27632. Pequenos fragmentos de organoides perturbados formarão pequenos organoides císticos dentro de 24 hr.

Dia 5:

16. Renove o meio e suplemente com um antibiótico de seleção (para puromicina, use 4 µg/mL).

Dia 7:

1. Substitua o meio por meio de cultura padrão de organoides, suplementado com antibiótico de seleção.
   NOTA: A brotação será concluída 2-3 semanas após a retirada de Chir99021. Após a seleção, os organoides podem ser cultivados sem antibióticos de seleção.

Resultados

Figura 1: Esquema da produção de lentivírus para transdução de organoides.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Polietileno imina	Polysciences	23966-2
Meio DMEM	Lonza	BE12-614F
Soro fetal bovino	Lonza	DE14-801F
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140-122
Glutamina	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
DMEM-F12 avançado	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetil cisteína	Sigma	A9165-1G
EGF murino	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
Glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
Polybrene	Sigma	107689
Nicotinamida	Sigma	N0636
Tripsina	Lonza	BE02-007E