Detecção da Ativação da Via SMAD Utilizando Transdução Dual com Adenovírus

Resumo

Fonte: Chen, H., et al.. Imageamento de Células Vivas do TGF-β/Ativação da Via de Sinalização Smad3 In Vitro e In Vivo Utilizando um Sistema Repórter com Adenovírus. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra um método para estudar a ativação da via SMAD em células de câncer de mama utilizando infecção dual por adenovírus. Um vírus veicula um gene GFP expresso constitutivamente, enquanto o outro carrega um repórter RFP sob um promotor sensível à SMAD. Após a estimulação por TGF-beta, as proteínas SMAD são ativadas, formando um complexo que induz a expressão de RFP. A detecção de sinais duplos em células vivas confirma a ativação da via.

Protocolo

1. Transdução com duplo adenovírus em células únicas vivas

1. Plante 1,0 - 1,5 x 10⁵ células MDA-MB-231 com 500 μL de meio de cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) contendo 5% de soro bovino fetal (FBS) em cada poço de uma placa de 12 poços (35% de confluência celular, 2 poços no total).
2. Infete as células com 75 μL do vetor adenoviral Ad-CMV-GFP (título = 5 x 10⁹ PFU/mL) e 7,5 μL do vetor adenoviral Ad-CAGA12-Td-Tom (título = 5 x 10¹⁰ PFU/mL) para obter uma multiplicidade de infecção (MOI) de 2.500, o que pode alcançar 100% de positividade de infecção.
3. Trate as células com ou sem 0,25 μL de fator de crescimento transformador beta (TGF-β) por poço (10 mg/mL em estoque, 5 ng/μL como concentração final) imediatamente após a infecção com adenovírus.
4. Coloque a placa no incubador a 37 °C com 10% de CO₂ por 24 h.
5. Image células vivas com um microscópio de fluorescência de contraste de fase. Excite a proteína verde fluorescente (GFP) em 470 nm e a proteína Td-Tomato em 554 nm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	ThermoFisher	1881024	Aquecer em banho-maria a 37 °C antes do uso
Soro bovino fetal	Scientifix Life	FBS500-S	Inativado pelo calor antes do uso
TGF-β1 humano recombinante	PEPROTECH	100-21	Aliquotar em água destilada para obter concentração final de 10 mg/mL
Microscopia de contraste de fase com fluorescência	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
Solução			Composição
FBS-DMEM			5% FBS inativado pelo calor; 10 μg/mL de penicilina; 100 μg/mL de estreptomicina