Imagens de Fluorescência Multiplexadas de Ácidos Nucleicos Virais e Proteínas em Linfócitos Humanos Infectados

Resumo

Fonte: Shah, R., et al. Imagem de Fluorescência Multiplexada em Célula Única para Visualizar Ácidos Nucléicos e Proteínas Virais e Monitorar Infecções por HIV, HTLV, HBV, HCV, Vírus Zika e Influenza. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a visualização simultânea de DNA, RNA e proteína do capsídeo do HIV-1 em linfócitos humanos infectados, utilizando hibridização de DNA ramificado e imunofluorescência, permitindo a análise detalhada das etapas da replicação viral em células individuais.

Protocolo

1. Imunomarcação de proteínas: Para rotular proteína(s) de interesse

1. Decante o PBS (solução salina tamponada com fosfato) e adicione 200 µL de tampão bloqueador (1% p/v BSA (albumina sérica bovina), 10% v/v FBS (soro bovino fetal) em PBS com 0,1% v/v Tween-20 (PBST) sobre o lamínula. Incube por 1 h à temperatura ambiente (TA).
2. Decante o tampão bloqueador e aplique 200 µL do anticorpo primário diluído em PBST + 1% p/v BSA. Incube por 1 h à temperatura ambiente.
3. Lave a lâmina duas vezes com PBST por 10 min à temperatura ambiente com agitação.
4. Aplique um anticorpo secundário de escolha por 1 h à temperatura ambiente em PBST + 1% p/v BSA.
5. Lave a lâmina com PBST por 10 min à temperatura ambiente com agitação.

2. Coloração nuclear: Contra-colorir núcleos após imunomarcação

1. Decante o PBST e adicione DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) ou corante nuclear de escolha por 1 min a RT.
2. Lave a lâmina duas vezes com PBS por 10 min a RT com agitação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-NS5a do VHC	Abcam	ab13833	Monoclonal de camundongo; funciona com os genótipos 1a, 1b, 3 e 4 do VHC
Anticorpo monoclonal anti-p24 do HIV-1	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anticorpo anti-Mov10	Abcam	ab80613	Policlonal de coelho
Albumina sérica bovina			Reagente bloqueador para imunomarcação
Meio celular com suplementos			Meio apropriado para o modelo celular
Lâminas de cobertura
DAPI	ACD Bio		Corante nuclear (kit RNAscope da ACD Bio)
Fosfato tamponado de Dulbecco (PBS 1X)	Gibco	14190250	Sem cálcio e magnésio
Soro bovino fetal (FBS)			Utilizar FBS específico com base no soro no qual o anticorpo secundário foi produzido (por exemplo, FBS de cabra)
Lâminas microscópicas Fisherbrand Colorfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Pré-limpas
Lâminas
Tween-20			Para tampão de hibridização de DNA e PBS-T