Purificação de Intassomos do Vírus Espumoso Protótipo por Cromatografia de Exclusão Molecular

Resumo

Fonte: Mackler, R. M., et al. Montagem e Purificação de Intassomos de Vírus Foamy Protótipos. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a purificação de intassomos do vírus da foamy protótipo (PFV) a partir de uma suspensão mista de proteína-DNA utilizando extração com sal e cromatografia de exclusão por tamanho, obtendo complexos ativos para análises posteriores.

Protocolo

1. Solubilização do Intassomo

1. Prepare dois bicos de pipeta de grande diâmetro removendo 2-4 mm da extremidade de uma ponta de 200 µL com uma lâmina nova de estilete ou bisturi sobre uma superfície limpa.
   NOTA: Os bicos serão usados nas etapas 1.3 e 1.5.
2. Remova o tubo de diálise do tampão de diálise. Para evitar a diluição da amostra de intassomo com tampão de diálise que possa permanecer na extremidade do tubo próximo ao clipe, use uma micropipeta com uma ponta pequena para remover qualquer excesso de tampão de diálise. Remova o clipe de uma das extremidades do tubo de diálise.
3. Use um bico de pipeta de grande diâmetro da etapa 1.1 para transferir a amostra, incluindo o precipitado dentro do tubo de diálise, para um tubo de 1,5 mL sobre gelo. 
   NOTA: O volume total do material recuperado é tipicamente de ~140 µL.
4. A amostra com precipitado está a 200 mM NaCl; aumente a concentração de sal para uma concentração final de 320 mM NaCl adicionando o volume apropriado de uma solução estoque de 5 M NaCl. Por exemplo, para uma amostra de 150 µL, adicione 3,9 µL de NaCl 5 M e 1,1 µL de ddH₂O para um volume final de 155 µL. Transfira o recipiente com gelo e a amostra para uma câmara fria a 4 ˚C.
5. Use um bico de pipeta de grande diâmetro da etapa 1.1 para ressuspender e solubilizar o precipitado por pipetagem. Repita a cada 20 minutos por pelo menos 1 hora. Observe que a maior parte do precipitado deve ir para a solução.
   NOTA: A pipetagem para ressuspender o precipitado pode ser interrompida quando for evidente que o precipitado não está mais visivelmente reduzido entre os intervalos de tempo. Quando o DNA viral (vDNA) não está marcado ou está marcado internamente, o precipitado é reduzido em ~90% com base na inspeção visual. No caso de vDNA marcado com Cy5 na extremidade, o precipitado é reduzido apenas em ~20%; a maior parte do precipitado com vDNA marcado com fluoróforo na extremidade não será solubilizada. A quantidade de precipitado efetivamente solubilizada é variável e deve ser determinada empiricamente.

2. Purificação do Intassomo

1. Prepare 250 mL de tampão de corrida para cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) (20 mM Bis-tris propano, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10% glicerol). Filtre esterilmente o tampão com uma unidade de filtro de 0,2 µm e armazene a 4 ˚C.
   NOTA: Todas as etapas de purificação são realizadas em uma câmara fria a 4 ˚C.
2. Equilibre uma coluna SEC de agarose reticulada (diâmetro = 10 mm; comprimento = 300 mm; volume da cama = 24 mL; volume da amostra = 25 - 500 µL; pressão máxima = 1,5 MPa; limite de exclusão = 4 x 10⁷ Da; separa pesos moleculares entre 5 e 5.000 kDa, veja a Tabela de Materiais) com o tampão de corrida SEC a uma vazão de 0,4 mL/min.
   NOTA: Esta purificação pode ser adaptada para diferentes colunas de exclusão por tamanho, desde que sejam capazes de separar efetivamente 300 kDa de 44 kDa, como Superose 12 10/300 GL ou Superose 6 Increase. A Superose 12 10/300 GL possui resolução mais baixa, levando a maior sobreposição de picos. Por outro lado, a Superose 6 Increase apresenta maior resolução e oferece melhor separação.
3. Centrifugue a amostra de intassomo em um microcentrífuga a 14.000 x g durante 10 min a 4 ˚C para pelotizar qualquer precipitado remanescente. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Carregue o sobrenadante em um loop de injeção de 200 µL (tubo capaz de conter ~200 μL). Aplique a amostra na coluna SEC.
   NOTA: Volumes de carga menores permitem maior resolução pela SEC.
4. Elua com 25 mL de tampão de corrida SEC e colete 95 frações de 270 µL. Observe que o cromatograma SEC exibe três picos de A₂₈₀/A₂₆₀ (Figura 1).
   NOTA: O primeiro deve ser um agregado (~9,0 - 11,5 mL de eluição), seguido pelo pico do intassomo tetramérico de PFV (~12,0 - 14,75 mL de eluição) e pelo pico do monômero de IN de PFV com vDNA livre (~15,0 - 18,0 mL).

Resultados

Figura 1: Cromatograma de exclusão por tamanho. Um complexo intassomo de PFV foi separado utilizando uma coluna de exclusão por tamanho de agarose. Esta coluna permite a separação do agregado (1), do intassomo de PFV composto por um tetrâmero de IN de PFV e dois vDNA (2) e da forma monomérica de IN de PFV e vDNA (3). Neste exemplo, o vDNA continha uma marcação interna com o fluoróforo Cy5, detectado por excitação em 650 nm. O eixo y indica a densidade óptica (DO) em unidades de milimilhaborbância (mAU).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Oligômeros de DNA	IDT	N/A	Oligos de DNA personalizados
NaCl	P212121	RP-S23020
BIS-TRIS propane, >=99,0% (titulação)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
Glicerol	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Pontas para carregamento de géis, 1 - 200 μL	Corning	CLS4853-400EA
Lâmina de barbear; de borda única; 100/unid.; pacote com 100	Fisher Scientific	12-640
Clips para tubos de diálise	Spectrum Labs	132734
Tubo de diálise 6-8 kDa, 10 mm	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201