Obtenção de RNA Viral para Análise por Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qPCR)

Resumo

Fonte: Suzuki, Y., et al. Medição de RNA do vírus da dengue no sobrenadante de cultura de células infectadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra o procedimento para preparar amostras virais para análise de PCR quantitativa (reação em cadeia da polimerase). Amostras virais e padrões de RNA são diluídos em série, tratados com um tampão de proteinase K e incubados sob temperaturas controladas para liberar o RNA. O RNA processado é então estabilizado e armazenado para quantificação dos níveis de RNA viral.

Protocolo

1. Processamento de Amostras de Vírus para RT-qPCR (reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real)

NOTA: Os passos 1.1–1.3 devem ser realizados dentro de uma cabine de segurança biológica. Em particular, o manuseio do sobrenadante celular contendo um vírus infeccioso deve ser conduzido em um ambiente de nível de biossegurança 2 (ou superior).

1. Misture 199 μL de um tampão de processamento e 1 μL de proteinase K livre de nucleases.
2. Dilua em série o RNA sintetizado da região 3’UTR (região não traduzida) do DENV (vírus da dengue) (ácido ribonucleico) na proporção de 1:10 para obter um padrão de RNA de 5 x 10⁹ a 5 x 10³ cópias/μL, utilizando meio de cultura celular (por exemplo, DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com 10% de soro bovino fetal e antibióticos [DMEM/10% soro bovino fetal]) contendo 40 unidades/mL de inibidor de RNase.
3. Misture 5 μL do sobrenadante da cultura de células infectadas com DENV e o padrão de RNA da região 3’UTR do DENV com 5 μL da solução de tampão de processamento/proteinase K, utilizando tiras de PCR de 8 tubos ou uma placa de PCR de 96 poços. Como controle sem molde (NTC), misture 5 μL de meio de cultura celular (ou seja, sem inclusão de vírus) com 5 μL da solução de tampão de processamento/proteinase K.
4. Após uma breve centrifugação, incube as amostras em um termociclador nas seguintes condições: 1 ciclo (25 °C por 10 min e 75 °C por 5 min).
NOTA: As amostras processadas podem ser mantidas a 4 °C se a análise de PCR em tempo real for realizada no mesmo dia. Para armazenamento de longo prazo, as amostras devem ser armazenadas a -80 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ciclador Térmico SimpliAmp	Thermo Fisher Scientific	A24811	Instrumento de ciclador térmico comparável, mas a condição do ciclo de PCR precisa ser otimizada.
Inibidor de RNase Recombinante	Takara Bio. Inc	2313A	40 unidades/μL
Kit RNeasy Mini	Qiagen	74104	Pode ser utilizado um kit de purificação de RNA comparável.
Proteinase K	Nacalai Tesque	15679-06	>600 unidades/mL. Pode ser utilizado um reagente comparável.
Placa de Reação MicroAmp Fast Optical de 96 Poços, 0,1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	Pode ser utilizada uma placa ou tubo comparável, dependendo do instrumento de PCR em tempo real, mas a condição do ciclo de PCR precisa ser otimizada.