Coleta de Partículas do Vírus da Hepatite E de Células de Câncer Hepático Humano

Resumo

Fonte: Meister, T. L., et al. Um Modelo de Cultura Celular para Produzir Estoques de Vírus da Hepatite E com Alto Título. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra o processo de isolamento de partículas do vírus da hepatite E (HEV) a partir de células de carcinoma hepatocelular humano transfectadas. Partículas virais extracelulares são coletadas de sobrenadantes filtrados, enquanto partículas intracelulares são liberadas submetendo as células a ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. O lisado é centrifugado e o sobrenadante contendo partículas de HEV é aliquotado e armazenado em temperatura ultra-baixa para uso futuro.

Protocolo

1. Preparação de células HepG2 para a produção de vírus da hepatite E derivado de cultura celular (HEVcc)
NOTA: Para evitar contaminação, a preparação das células, eletroporação, infecção, coleta e fixação celular foram realizadas em condições estéreis em uma instalação de nível de biossegurança 2. Os passos de incubação a 37 °C que envolvem células foram realizados em uma incubadora com 5% de CO₂.

1. Para preparar células HepG2 para a produção de HEVcc (Figura 1), semeie as células em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) completo (consulte a Tabela 1) em uma placa de cultura de 15 cm revestida com colágeno (consulte a Tabela 1; filtre esterilmente a mistura de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e ácido acético através de malha de 0,2 µm antes de adicionar o colágeno). Incube a 37 °C até que as células atinjam 90% de confluência.
   NOTA: Cada placa de 15 cm contendo células com 90% de confluência gerará quantidade suficiente de células para até 4 eletroporações.
2. Remova cuidadosamente o meio da placa e lave as células uma vez com 10 mL de PBS 1x. Tripsinize as células adicionando 3 mL de tripsina-EDTA 0,05% sobre as células e incube a 37 °C até que as células se desprendam completamente. Re-suspenda as células em 10 mL de meio DMEM completo e transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mL. Determine o número total de células.
3. Como cada eletroporação exige 5 x 10⁶ células, transfira o volume apropriado para um novo tubo de 50 mL e complete com pelo menos 35 mL de PBS 1x. Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
4. Lave as células mais uma vez com 35 mL de PBS 1x a 200 x g durante 5 min. Coloque as células no gelo e ainda não remova o PBS 1x, para manter as células em suspensão.

2. Eletroporação de células HepG2

1. Para a eletroporação de células HepG2 (Figura 2), prepare 400 µL de Cytomix completo por eletroporação, suplementando 384 µL de Cytomix (consulte a Tabela 1) com ATP 2 mM e Glutationa 5 mM. Prepare imediatamente antes do uso e coloque diretamente no gelo.
   NOTA: Uma execução correta e rápida dos próximos passos é crucial. Portanto, certifique-se de que tudo esteja devidamente preparado.
2. Remova cuidadosamente o PBS 1x sem perturbar o pellet celular do passo 4.4. Re-suspenda 5 x 10⁶ células em 400 µL de Cytomix completo e adicione 5 µg de RNA. Transfira a solução para uma cubeta de 4 mm e aplique um pulso único com 975 µF, 270 V durante 20 ms utilizando um sistema de eletroporação.
   1. Após a eletroporação, transfira as células o mais rapidamente possível com uma pipeta de Pasteur para 11 mL de DMEM completo por eletroporação.
      NOTA: Para garantir que o RNA foi transfectado com sucesso nas células HepG2, será realizado um controle de transfeção (TC). As taxas esperadas de transfeção variam entre 40-60% de células positivas para ORF2.
3. Transfira 10 mL das células eletroporadas para uma placa de cultura de 10 cm revestida com colágeno. Adicione 1,3 x 10⁵ células eletroporadas (300 µL) em um poço de uma placa de microtitulação de 24 poços revestida com colágeno contendo um lamínula (utilizada posteriormente como controle de transfeção). Distribua as células uniformemente e incube a 37 °C.
   1. Após 24 h, troque o meio na placa de 10 cm e substitua por 10 mL de DMEM completo fresco. Não troque o meio do controle de transfeção. Incube por mais 6 dias a 37 °C.

3. Coleta de HEV derivado de cultura celular (HEVcc) intra- e extracelular

1. Para colher partículas extracelulares de HEVcc (Figura 3), filtre o sobrenadante obtido do recipiente de 10 cm após 6 dias através de uma malha de 0,45 µm para remover qualquer debris celular. Armazene o HEVcc extracelular colhido a 4 °C para infecção no mesmo dia; caso contrário, armazene a -80 °C.
2. Para colher partículas intracelulares de HEVcc (Figura 3), lave as células com PBS 1x e faça a tripsinização adicionando 1,5 mL de tripsina-etilenodiaminotetraacetato a 0,05% (tripsina-EDTA). Incube a 37 °C até que as células estejam completamente destacadas. Adicione 10 mL de DMEM completo, enxágue a placa para destacar as células e transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mL. Lave as células duas vezes com PBS. Centrifugue a 200 x g durante 5 min.
   1. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1,6 mL de DMEM completo por eletroporação. Transfira a suspensão celular para um tubo de reação de 2 mL.
      NOTA: Não utilize volumes maiores, pois isso diminuiria drasticamente as cargas virais.
   2. Congele (em nitrogênio líquido) e descongele as células. Repita esta sequência 3 vezes.
      NOTA: Não reúna mais de uma eletroporação (1,6 mL) para os 3 ciclos de congelamento e descongelamento, pois a eficiência de lise seria prejudicada. Não vortexe a suspensão celular entre os ciclos. Certifique-se de descongelar lentamente a suspensão celular (por exemplo, à temperatura ambiente ou sobre gelo) para maximizar as cargas virais.
   3. Centrifugue em alta velocidade as células lisadas por 10 min a 10.000 x g para separar os debris celulares. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Utilize o sobrenadante para infecção; caso contrário, armazene a -80 °C.
   4. Opcionalmente, concentre o HEVcc extracelular e intracelular utilizando um concentrador para aumentar as cargas virais.

Tabela 1: Tabela da Composição do Tampão.

Solução de trabalho	Concentração	Volume
Colágeno	40 mL	PBS
	40 µl	Ácido acético
	1 mL	Solução estéril de colágeno R 0,4%
Cytomix	120 mM	KCl
	0,15 mM	CaCl2
	10 mM	K2HPO4 (pH 7,4)
	25 mM	HEPES
	2 mM	EGTA
DMEM completo	500 mL	DMEM
	5 mL	Pen/Strep
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutamina
	50 mL	Soro bovino fetal
MEM completo	500 mL	MEM
	5 mL	Piruvato de sódio
	5 mL	Gentamicina
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutamina
	50 mL	ultra-low IgG

Resultados

Figura 1: Esquema do delineamento experimental para o preparo de células HepG2 para a produção de vírus da hepatite E derivado de cultura celular (HEVcc).

Figura 2: Configuração esquemática do experimento para a eletroporação de células HepG2.

Figura 3: Esquema da montagem experimental para coleta de HEVcc intra- e extracelular.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Malha de 0,45 µm	Sarstedt	83.1826	Coleta de vírus extracelular
MEM	gibco	31095-029	Cultura celular
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Cultura celular
Tripsina-EDTA (0,5 %)	gibco	15400054	Cultura celular
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	Cultura celular
Ácido acético	CarlRoth	6755.1	Solução trabalhadora de colágeno
ATP	Roche	11140965001	Transcrição in vitro e eletroporação
BioRender	BioRender		Geração de figuras
Cloreto de cálcio	Roth	5239.2	Cytomix
Solução de colágeno R estéril a 0,4 %	Serva	47256.01	Solução trabalhadora de colágeno
DMEM	gibco	41965-039	Cultura celular
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	Eletroporação
HEPES	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Fosfato de di-potássio	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
Fosfato de potássio monoácido	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamina	gibco	25030081	Cultura celular
Glutationa reduzida	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	Cultura celular
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Cultura celular
Cloreto de magnésio	Roth	2189.2	Cytomix
Espectrofotômetro microvolume UV-Vis NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Concentração de DNA/RNA
PBS	gibco	70011051	Cultura celular
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Cultura celular