Reprogramação de Células Sanguíneas Humanas em Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Mediada por Vírus Sendai

Resumo

Fonte: Rim, Y. A., et al. Geração de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas a Partir de Células Sanguíneas Utilizando Vírus Sendai e Centrifugação. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra a geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células mononucleares do sangue periférico humano utilizando reprogramação mediada por vírus Sendai. Os fatores de transcrição virais ativam redes de pluripotência e suprimem genes de linhagem, permitindo que um subconjunto de células adquira propriedades de adesão e estabeleça colônias de iPSCs. O protocolo enriquece e mantém essas células reprogramadas por meio de ligação seletiva à matriz e renovação diária do meio de cultura.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do CEP do instituto.

1. Transdução por Vírus Sendai

1. Transdução (Dia 0)
   1. Coletar e transferir as células sanguíneas para um tubo cônico de 15 ml e contá-las utilizando um hemocitômetro.
   2. Preparar 3 x 10⁵ células por transdução e centrifugar as células a 515 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT).
   3. Descartar o sobrenadante por sucção e ressuspender as células em 0,5 ml de meio para células sanguíneas.
   4. Transferir as células para um poço de uma placa de 24 poços não revestida.
   5. Descongelar a mistura do vírus Sendai em gelo e adicioná-la às células suspensas. Adicionar o vírus Sendai às células conforme as recomendações do fabricante.
   6. Fechar a placa com uma película selante e centrifugá-la a 1.150 x g por 30 min a 30 °C.
   7. Após a centrifugação, incubar as células a 37 °C em 5% de CO₂ durante a noite (O/N).
2. Transferência celular para matriz com células de apoio (Dia 1)
   1. No dia seguinte, revestir uma placa de 24 poços com vitronectina. Diluir a solução de vitronectina em PBS para obter uma concentração final de 5 µg/ml. Adicionar 1 ml de vitronectina a um poço de uma placa de 24 poços e incubá-la à temperatura ambiente por pelo menos 1 hora. Remover a solução de revestimento antes do uso. As placas revestidas podem ser armazenadas à temperatura ambiente por até 3 dias.
   2. Transferir todo o meio contendo as células e o vírus para o poço revestido.
   3. Coletar as células remanescentes com um volume adicional de 0,5 ml de meio fresco para células sanguíneas e adicioná-las ao poço que contém as células.
   4. Centrifugar a placa a 1.150 x g por 10 min a 35 °C.
   5. Após a centrifugação, remover o sobrenadante, adicionar 1 ml de meio para iPSC e manter as células a 37 °C em 5% de CO₂ durante a noite (O/N).
3. Segunda transferência celular (Dia 2)
   1. Revestir os poços de uma nova placa de 24 poços com vitronectina a 5 µg/ml, conforme descrito na etapa 1.2.1. Utilizar um poço da placa para cada transdução.
   2. Transferir a suspensão celular da primeira placa para a placa de vitronectina recém-revestida.
      NOTA: Se não forem necessárias, as células em suspensão podem ser descartadas. O procedimento mencionado na etapa 2.3 pode ser repetido 2-3 vezes com as células em suspensão. Se os passos forem repetidos, colher as células.
   3. Enquanto isso, adicionar 1 ml de meio para iPSC (células-tronco pluripotentes induzidas) ao poço da primeira placa, para manutenção, e incubá-lo a 37 °C em 5% de CO₂ durante a noite (O/N).
   4. Manter as células aderidas a 37 °C e 5% de CO₂ e realizar uma troca diária de meio com meio fresco para iPSC. Colônias aparecerão entre os dias 14 e 21 após a transdução.
   5. Centrifugar a placa recém-revestida contendo as células em suspensão a 1.150 x g e 35 °C por 10 min.
   6. Após a centrifugação, incubar as células a 37 °C em 5% de CO₂ durante a noite (O/N).
   7. No dia seguinte, remover o sobrenadante e substituí-lo por meio fresco para iPSC.
      NOTA: O procedimento mencionado na etapa 1.3 pode ser repetido 2-3 vezes com as células em suspensão. Se os passos forem repetidos, colher as células no sobrenadante e repetir a etapa 1.3.
   8. Manter as células aderidas com trocas diárias de meio até atingir 80% de confluência.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Material plástico
Tubo cônico de 50 ml	SPL	50050
Tubo cônico de 15 ml	SPL	50015
Pipeta descartável de 10 ml	Falcon	7551
Pipeta descartável de 5 ml	Falcon	7543
Placa de 12 poços	TPP	92012
Placa de 24 poços	TPP	92024
Materiais para Geração e Cultivo de iPSCs
Kit de Reprogramação CytoTune-iPSC com Vírus Sendai	Life Technologies	A16518
Meio TeSR-E8	STEMCELL Technologies	5940	meio para iPSCs
Vitronectina	Life Technologies	A14700
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Solução para destacar colônias