Análise da Internalização do Vírus Influenza Utilizando um Ensaio de Bloqueio com Estreptavidina

Resumo

Fonte: Pohl, M. O. & Stertz, S. Medição da Aderência e Internalização do Vírus Influenza A em Células A549 por Citometria de Fluxo. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o uso de um ensaio de bloqueio com estreptavidina para distinguir o vírus da gripe ligado à superfície daquele internalizado em células epiteliais pulmonares humanas. A comparação dos sinais de fluorescência mostra que uma intensidade mais alta após a incubação indica internalização viral bem-sucedida.

Protocolo

1. Ensaio de Aderência/Internalização

NOTA: Certifique-se de preparar todos os reagentes antes de iniciar o ensaio. Para os três grupos-controle apresentados na seção de resultados (células mock-infectadas, células pré-tratadas com neuraminidase e células tratadas com azida de sódio), são necessárias pequenas alterações no protocolo.

1. Prepare 16 tubos de fundo cônico, cada um contendo 200.000 células A549. Além do conjunto experimental composto por 4 tubos, existem 3 condições de controle, cada uma exigindo 4 tubos: células mock-infectadas, células pré-tratadas com neuraminidase (NA) e células tratadas com azida de sódio. Cada grupo é composto por 4 tubos rotulados como ‘0 min’, ‘0 min + streptavidina (STV)’, ‘30 min’, ‘30 min + STV’.
2. Centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 µl de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
3. Centrifugue os tubos a 4 °C a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 µl de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 0,3% de albumina sérica bovina (BSA), 20 mM de 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico (HEPES) e 1% de penicilina-estreptomicina (meio de incubação). Incube por 30 min a 37 °C.
   NOTA: Para o controle com neuraminidase: Utilize neuraminidase bacteriana (por exemplo, sialidase de Vibrio cholera) na concentração de 200 mU/ml diluída no meio de incubação para ressuspender as células.
4. Centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 µl de PBS. Repita este passo mais uma vez e, em seguida, resfrie os tubos no gelo por 10 min.
5. Centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 µl de vírus biotinilado (utilize a concentração de vírus determinada na seção 2 diluída em PBS de infecção). Incube por 1 h no gelo.
6. Centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 µl de PBS. Repita este passo mais uma vez.
   NOTA: Para o controle mock-infectado: Utilize PBS de infecção sem vírus. Para o controle com azida de sódio: Utilize vírus diluído em PBS de infecção suplementado com 0,1 % de azida de sódio.
7. Processamento das amostras após a infecção no gelo:
   1. Para as amostras de ‘0 min’, siga o passo 2,5 e armazene as amostras a 4 °C até que as demais amostras sejam fixadas.
   2. Para as amostras de ‘0 min + STV’, centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 50 µl de STV (utilize a concentração determinada na seção 3) diluída em PBS contendo 2% de BSA e 0,1% de azida de sódio (para prevenir internalização durante o manuseio da amostra). Incube por 30 min no gelo.
   3. Centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 µl de PBS. Repita este passo mais uma vez.
   4. Para fixação, centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 µl de paraformaldeído a 3,7% (PFA). Incube por 10 min à temperatura ambiente (RT). Em seguida, repita o passo de lavagem descrito no 1.6) e armazene as amostras a 4 °C.
   5. Para as amostras de ’30 min’, centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 µl de PBS contendo 2% de BSA. Incube por 30 min a 37 °C. Siga os passos 1.7.3-1.7.4 e armazene as amostras a 4 °C.
      NOTA: Para o controle com azida de sódio: Utilize PBS suplementado com 2 % de BSA e 0,1 % de azida de sódio para a incubação de 30 min a 37 °C.
   6. Para as amostras de ’30 min + STV’, centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 µl de PBS contendo 2% de BSA. Incube por 30 min a 37 °C. Em seguida, centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 50 µl de STV (utilize a concentração determinada na seção 3) diluída em PBS contendo 2% de BSA e 0,1% de azida de sódio (para prevenir internalização durante o manuseio da amostra). Incube por 30 min no gelo. Siga os passos 1.7.3-1.7.4 e armazene as amostras a 4 °C.
      NOTA: Para o controle com azida de sódio: Utilize PBS suplementado com 2 % de BSA e 0,1 % de azida de sódio para a incubação de 30 min a 37 °C.
8. Para permeabilização, centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 µl de PBS contendo 0,5% de Triton X-100. Incube por 6 min à temperatura ambiente. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito no 1.6).
9. Centrifugue os tubos a 4 °C por 3 min a 450 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 50 µl de 2% de BSA diluída em PBS contendo STV-Cy3. (Observe que a concentração apropriada de STV-Cy3 deve ser determinada antes de iniciar o experimento. Comece com uma concentração de 1:200 e teste diluições em duas vezes até 1:2.400. Em nossos experimentos, uma diluição de 1:1.000 mostrou-se ideal.)
10. Incube por 1 h no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito no 1.6, mas ressuspenda o pellet em 200 µl de 2% de BSA diluída em PBS.
11. Analise as amostras por citometria de fluxo. Determine a porcentagem de células positivas para Cy3 em cada amostra.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Life Technologies	41966-052
SFB	Life Technologies	10270-106
Penicilina-Estreptomicina	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sacarose	Fluka	84100
Ensaio de Proteína Bio Rad	Bio Rad	500-0006
Tubos de fundo profundo (microtubos de 1,2 ml)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
Tubos para ultracentrifugação	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
Azida de sódio	Fluka	71290
Neuraminidase/sialidase bacteriana	Sigma-Aldrich	N6514-1UN