Avaliação da Inibição do Crescimento Bacteriano Mediada por Fagos Utilizando Medições de Densidade Óptica

Resumo

Fonte: Niu, Y. D., et al. Eficácia de Bacteriófagos para o Biocontrole de Patógenos Transmitidos por Alimentos Avaliada por Meio de Configurações de Alto Rendimento. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em microplacas para avaliar a atividade lítica de coquetéis de fagos contra culturas bacterianas de E.coli. Destaca como as alterações na densidade óptica revelam a potência do fago e a concentração necessária para inibição bacteriana completa

Protocolo

1. Preparação do tampão e reagentes

1. Prepare 500 mL de caldo triptona soja (TSB) (15 g de pó de TSB e 500 mL de água ultrapura) e autoclave.
   NOTA: Este pode ser armazenado à temperatura ambiente por até 3 meses ou a 4 °C por até 6 meses.
2. Prepare 500 mL de ágar triptona soja (TSA) (20 g de pó de TSA e 500 mL de água ultrapura) e autoclave.
   NOTA: Este pode ser armazenado a 4 °C por até 3 meses.
3. Prepare 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS; 4 g de NaCl, 0,1 g de KCl, 0,77 g de Na₂HPO₄, e 0,12 g de KH₂PO₄, 500 mL de água ultrapura), meça e ajuste o pH para 7,2 ± 0,2 a 25 °C e autoclave.
   NOTA: Este pode ser armazenado a 4 °C por até 6 meses.
4. Prepare 200 mL de MgSO₄ 1 M (49,294 g e 200 mL de água ultrapura) e esterilize por filtração com filtro de polietersulfona de 0,22 µm.
5. Prepare 500 mL de TSB com MgSO₄ 10 mM (mTSB; 15 g de pó de TSB, 500 mL de água ultrapura e 5 mL de MgSO₄ 1 M) e autoclave; deixe o meio autoclavado esfriar à temperatura ambiente. Aplique a técnica asséptica. Usando uma pipeta serológica, transfira cuidadosamente 5,0 mL de MgSO₄ 1 M; agite suavemente para homogeneizar.

2. Preparação da cultura bacteriana

1. Para preparar o Cultivo de Laboratório para Pesquisa Bacteriana (BRLC), retire o(s) frasco(s) de estoque glicerinado do inventário do congelador e transfira para o laboratório.
2. Utilizando um alça de inoculação descartável ou equivalente, mergulhe no frasco, retire uma porção do inóculo (gelo congelado) e risque uma placa de TSA ou equivalente dentro de uma cabine de segurança biológica de nível II. Incube a placa a 37 ± 2 °C por 15−18 h.
3. Coloque as placas de BRLC preparadas em saco plástico e armazene a 4 °C.
   NOTA: Período geral de validade do BRLC: 14 dias a 4 °C após a preparação.
4. Inocule uma única colônia de cada cepa de E. coli O157 das placas de BRLC a serem testadas em 10 mL de TSB e incube estaticamente a 37 °C por 18 h para atingir 9 log10 UFC/mL.
5. Prepare uma diluição seriada dos cultivos de overnight (na manhã seguinte), utilizando para cada cepa de E. coli O157 mTSB contendo 10 mM de MgSO₄, para obter 4-5 log10 UFC/mL (ou outro nível de inóculo desejado).
6. Misture volumes iguais do cultivo de overnight de cada cepa para obter um total de 4-5 log10 UFC/mL (ou conforme desejado) e preparar a mistura bacteriana.
7. Coloque imediatamente o cultivo bacteriano diluído a 4 °C para uso posterior.
8. Dilua o cultivo inóculo 10 ou 100 vezes e plaque alíquotas de 0,1 mL dessas diluições em placas de TSA para obter colônias isoladas.

3. Preparação das soluções de trabalho de fagos

1. Propague estoques de trabalho com alta titulação para cada fago a ser analisado (≥108 PFU/mL) seguindo os métodos padrão4.
   NOTA: O período geral de validade dos estoques de fago é de 3 meses em frasco plástico a 4 °C após a sua obtenção.
2. Para atingir a titulação desejada, por exemplo, ~10⁸ PFU/mL para a cinética de lise, dilua preparações individuais de fago com mTSB contendo 10 mM de MgSO₄. Prepare coquetéis de fagos misturando volumes iguais de cada estoque de trabalho com a mesma titulação em todas as combinações possíveis.

4. Preparação de in vitro cinética de lise para fagos individuais e coquetéis de fagos

1. Prepare diluições seriadas de 10 vezes de cada fago nas Colunas 1-8 em microplacas estéreis de 96 poços para montar o ensaio em microplaca.
   NOTA: Quatro fagos contra uma cepa bacteriana podem ser testados em duplicata, em colunas adjacentes, em cada placa. As quatro colunas restantes são para controles, sem fago, bem como o branco de mTSB (Figura 1).
2. Adicione 180 µL de mTSB aos poços das Colunas 1 a 12 da microplaca de 96 poços.
3. Adicione 20 µL de fagos individuais diluídos ou coquetéis de fagos (~108 PFU/mL) aos poços 1-8 da primeira linha da microplaca (Linha A).
4. Para os controles sem fago e em branco, adicione 20 µL de mTSB ao poço superior das Colunas 9, 10 e 11.
5. Com uma pipeta de 12 canais, realize a diluição na placa. Transfira 20 µL de linha para linha. Misture bem o conteúdo por aspiração e ejeção suaves repetidas (pelo menos cinco vezes), trocando as ponteiras entre as diluições. Remova 20 µL da última linha (Linha H).
   NOTA: Recomenda-se o uso de ponteiras com filtro para prevenir contaminação cruzada.
6. Monte um reservatório para cada cepa. Use uma pipeta de 1 mL para transferir 2-3 mL do cultivo diluído para o reservatório. Para as colunas 1-10, use uma pipeta multicanal para adicionar 20 µL do cultivo bacteriano diluído a cada poço. Troque as ponteiras após cada adição.
7. Cubra e incube a microplaca nas condições desejadas (por exemplo, 37 °C por 10 h ou 22 °C por 22 h).
8. A cada 2 h ou em outros intervalos desejados, retire as microplacas do incubador.

Resultados

Figura 1: Layout sugerido para o ensaio em microplaca de 96 poços. Diluições seriadas de 10 vezes de cada fago são preparadas nas colunas 1-8 de microplacas estéreis de 96 poços. Quatro fagos contra uma única cepa bacteriana podem ser testados em duplicata, em colunas adjacentes, em cada placa. As colunas restantes são destinadas aos controles.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suprimentos, reagentes e equipamentos essenciais
Heptaidrato de sulfato de magnésio	Sigma	1374361
Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipeta Pipet-Lite LTS L-300XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipeta Multicanal Pipet-Lite L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Pipeta Pipet-Lite, Unv. SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
Pontas de pipeta RT LTS 1000µL FL 768A/8 — baixa retenção	METTLER TOLEDO	30389213
Pontas de pipeta SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
Reservatório	METTLER TOLEDO	89094-662
Placas microplacas estéreis, transparentes, de 96 poços com fundo plano, em poliestireno, com tampas	Fisher	168055
Ágar tripticaseína soja (TSA)	Sigma	105458-0500
Caldo tripticaseína soja (TSB)	Sigma	105459-0500
Espalhadores celulares em formato T	VWR	76299-566
Instrumentos
Incubadoras microbiológicas compactas	Fisher	50125590H
Barras de agitação em formato poligonal	FIsher	14-512-125	comprimento: 20 mm
Leitor Híbrido Multimodo Synergy Neo2	Fisher	BTNEO2M
Software
SAS	SAS Institute	9.4