Marcação de Genomas de HSV-1 em Replicação com um Análogo de Nucleosídeo

Resumo

Fonte: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purificação de DNA viral para a Identificação de Proteínas Virais e Celulares Associadas. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a infecção de células de mamíferos em fase estacionária com HSV-1 (Vírus do Herpes Simples-1), seguida pela replicação do genoma viral utilizando a maquinaria de replicação do hospedeiro e do próprio vírus. Um análogo sintético de nucleosídeo é incorporado ao DNA viral recém-sintetizado para rotular os genomas em replicação, os quais são posteriormente isolados para análise proteômica das proteínas associadas do hospedeiro e virais.

Protocolo

1. Cultura Celular, Infecção Viral e Marcação com EdC (5-Etinil-2′-deoxicitidina) (Figura 1)

O protocolo a seguir envolve o trabalho com vírus. Consulte os protocolos de biossegurança da sua instituição sobre o manuseio seguro de vírus e outros agentes biológicos. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Pittsburgh.

1. Triesar uma placa de cultura tecidual de 150 cm² com células MRC-5 em confluência e transferir as células para uma placa de cultura tecidual de 600 cm² contendo 100 mL de DMEM (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco) mais 10% de FBS. Incubar a 37 °C na presença de 5% de CO₂ durante 3 a 4 dias até atingir confluência e fase estacionária. Uma placa de 600 cm² confluente contém aproximadamente 7 x 10⁷ células. Preparar 1 placa para cada condição e 1 placa para cada controle negativo correspondente.² frasco de cultura de tecidos com células MRC-5 (linhagem celular Medical Research Council 5) e transferir as células para uma placa de cultura de tecidos de 600 cm² contendo 100 mL de DMEM (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco) mais 10% de FBS. Incubar a 37 °C na presença de 5% CO₂₂ por 3 - 4 dias para atingir confluência e fase estacionária. Uma placa de 600 cm² confluente contém ~7 x 10⁷ Prepare 1 placa para cada condição e 1 placa para cada controle negativo correspondente.
   NOTA: As células devem atingir a fase estacionária para inibir a replicação do DNA celular, garantindo que apenas o vDNA (DNA viral) seja marcado e purificado nas etapas subsequentes.
   NOTA: Cada amostra requer um controle negativo não rotulado complementar, preparado utilizando as mesmas condições de infecção e ponto temporal, sem a adição de EdC.
   NOTA: Uma versão reduzida deste experimento deve ser realizada em paralelo para testar a marcação do DNA celular por meio de imagem, utilizando condições comparáveis de crescimento celular, infecção, marcação com EdC e pontos de tempo (ver Etapa 2).
2. Dilua 7 x 10⁸ UF (unidades formadoras de placa) HSV-1 em 7 mL de solução salina tamponada com Tris (TBS) fria. Remova o meio de crescimento e armazene a 37 °C. Para infectar, adicione o vírus diluído em 7 mL às células MRC-5 e agite suavemente por 1 h à temperatura ambiente. Após a adsorção, remova o inóculo, lave com 50 mL de TBS à temperatura ambiente e substitua pelo meio de crescimento original. Incube a 37 °C na presença de 5% CO₂₂Este passo deve ser realizado para cada condição experimental e controle negativo.
   NOTA: Pode-se obter um aumento na marcação com EdC utilizando mutantes do HSV-1 com defeito na expressão da dUTPase viral (gene UL50) e/ou da uracil glicosilase (gene UL2). A dUTPase do HSV-1 possui baixa especificidade de substrato e pode reduzir a ativação de diversos análogos de nucleosídeos.
3. Rotule os genomas virais com EdC. Siga as instruções para rotular genomas entrantes (1.3.1.), genomas em replicação (1.3.2.) ou forquilhas de replicação viral (1.3.3.).
   OBSERVAÇÃO: Apenas o Passo 1.3.1, 1.3.2 ou 1.3.3 deve ser realizado, dependendo se genomas entrantes, genomas replicados ou forquilhas de replicação devem ser analisados nas etapas subsequentes, respectivamente.
   NOTA: EdU ou f-ara EdU podem ser substituídos por EdC. A toxicidade dos análogos de nucleosídeos deve ser monitorada e minimizada.
   1. Utilize estoques pré-marcados para realizar a infecção no Passo 1.2 e prossiga para o Passo 2 ou 3 dentro de 4 h pós-infecção (hpi) para investigar o vDNA não replicado (Figura 1A).
      NOTA: Prepare estoques de vírus pré-marcados utilizando o protocolo previamente descrito25. Os estoques de vírus devem ser passados por uma coluna G-25 para remover qualquer EdC residual.
   2. Marque o vDNA em replicação adicionando 5 - 25 µM EdC ao meio de cultura de células infectadas por 2 - 4 h (Figura 1B). Antes de adicionar, dilua EdC em 1 mL de meio de crescimento.
   3. Para rotular as forquilhas de replicação viral, após o início da replicação do vDNA (≥4 hpi), rotule em pulso o vDNA em replicação com 5 - 25 µM EdC por 5-20 min. Para o chasing, lavar 3x com meio de chasing contendo 25 - 100 µM 2´desoxicitidina (deoxyC) e, em seguida, incubar na presença do meio de chasing por mais 20-40 min (Figura 1C).
      NOTA: O meio de pulso e chasedeve ser equilibrado a 37 °C e 5% CO₂₂ antes do uso.
      NOTA: Para experimentos de pulso e marcação, é importante considerar o tempo necessário para que os nucleosídeos entrem na célula e sejam fosforilados antes de serem incorporados ao DNA em replicação. Isso deve ser determinado empiricamente.
      NOTA: Para determinar a resolução dos experimentos de pulso e marcação sequencial, calcule a taxa de replicação viral nas condições experimentais utilizadas. Isso pode ser determinado por PCR quantitativa de genomas virais durante um curso de tempo de crescimento em um único passo.

Resultados

Figura 1: Abordagens para marcar o DNA do HSV-1. (A) Para analisar o estado do vírus entrante, células MRC-5 em repouso na fase G0 são infectadas com HSV-1 previamente marcado e os genomas são analisados em menos de 4 hpi para estudar o DNA viral não replicado. (B) Para analisar o estado do vírus replicado, células MRC-5 são infectadas com HSV-1 não marcado e EdC (estrelas laranjas) é adicionado ao meio de cultura das células infectadas e incubado por 2 - 4 h após o início da replicação do DNA viral (≥4 hpi). (C) Para analisar as forquilhas de replicação viral, células infectadas são marcadas em pulso com EdC por 5-20 min. As forquilhas de replicação podem então ser perseguidas com deoxyC. O DNA marcado com EdC é laranja. Esta figura foi modificada de Dembowski e DeLuca

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células MRC-5	ATCC	CCL-171
Soro bovino fetal (FBS)	Gibco	26140-179
Meio Essencial Mínimo Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	12800-082	Substituído com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 12 mM (para crescimento em frascos) ou 30 mM (para crescimento em placas) de bicarbonato de sódio
Placa de cultura celular de 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
Solução salina tamponada com Tris (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricina
Estoque de HSV-1			Estoques com título maior que 1x10⁹ PFU/mL apresentam melhor desempenho
5′-Etnil-2′-desoxicitidina (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Dissolver em DMSO para preparar estoque de 40 mM, alíquotas e armazenar a -20 °C
Incubadora de cultura celular
Capa de segurança biológica
Blocos térmicos			65 °C e 95 °C