Isolamento de Proteínas de Complexos DNA Viral-Proteína

Resumo

Fonte: Dembowski, J. A., et al. Purificação de DNA Viral para a Identificação de Proteínas Virais e Celulares Associadas. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra o isolamento de complexos proteína–DNA viral de núcleos celulares utilizando química click e purificação com esferas magnéticas. O protocolo envolve a marcação de genomas virais com nucleotídeos modificados com alquino, biotinilação por meio de uma reação click e ligação a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Após lavagem e eluição térmica, os complexos purificados são coletados, congelados rapidamente e armazenados para análises posteriores.

Protocolo

1. Purificação de vDNA e Proteínas Associadas

NOTA: Todos os tampões e reagentes devem ser resfriados em gelo antes do uso, e todas as etapas devem ser realizadas em gelo, salvo indicação em contrário.

1. Coletar núcleos. OBSERVAÇÃO: Antes do isolamento de núcleos, a formaldeído pode ser usada para promover a reticulação de proteínas ao DNA. Condições de lavagem mais rigorosas podem então ser utilizadas durante a purificação do DNA em esferas magnéticas revestidas com estreptavidina.
   1. Substitua o meio de crescimento por 20 mL de tampão de extração de núcleos (NEB) e incube por 20 min a 4 °C com agitação ocasional. Os núcleos tornar-se-ão visíveis ao microscópio.
   2. Desprenda os núcleos da placa usando uma espátula para células e transfira para um tubo cônico de 50 mL. Centrifugue por 10 min a 2.500 x g a 4 °C para formar o pellet de núcleos; descarte o sobrenadante.
      OBSERVAÇÃO: A coloração com azul de tripano pode ser usada para verificar o isolamento de núcleos a partir das células.
   3. Desloque suavemente o pellet nuclear em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), transfira para um tubo cônico de 15 mL e faça o pellet por centrifugação por 10 min a 2.500 x g a 4 °C. Remova completamente o PBS.
      OBSERVAÇÃO: Os núcleos podem ser congelados e o protocolo pode ser interrompido neste ponto. Para isso, ressuspenda suavemente o pellet nuclear em 500 µL de tampão de congelamento e incube o tubo em um banho de etanol/gelo seco. Armazene os núcleos congelados a -80 °C. Antes do uso, descongele os núcleos à temperatura ambiente, transfira rapidamente para gelo, adicione 10 mL de PBS, agite suavemente para homogeneizar, faça o pellet por centrifugação por 10 min a 2.500 x g a 4 °C e remova completamente o PBS. O congelamento dos núcleos pode resultar em menor rendimento.
2. Conjugue covalentemente biotina-azida ao DNA viral ou vDNA marcado com 5-etinil-2′-desoxicitidina (EdC).
   1. Ressuspenda o pellet nuclear em 10 mL de mistura de reação "click" [consulte a Tabela de Materiais] pipetando suavemente para cima e para baixo cinco vezes com uma pipeta de 10 mL.
      OBSERVAÇÃO: É importante que os reagentes incluídos na mistura de reação "click" sejam adicionados na ordem indicada.
   2. Incube em rotação por 1 h a 4 °C. Enquanto isso, prepare e resfrie os Tampões B1, B2 e B3 [consulte a Tabela de Materiais].
   3. Faça o pellet dos núcleos por centrifugação por 10 min a 2.500 x g a 4 °C. Remova completamente a mistura de reação "click" e lave o pellet ressuspendendo-o suavemente em 10 mL de PBS e centrifugando por 10 min a 2.500 x g a 4 °C.
   4. Ressuspenda suavemente o pellet nuclear em 1 mL de PBS e transfira para um tubo microcêntrifugo de 1,5 mL usando uma ponteira de grande diâmetro. Faça o pellet dos núcleos por centrifugação por 10 min a 2.500 x g a 4 °C. Remova completamente o PBS e congele rapidamente em nitrogênio líquido.
      OBSERVAÇÃO: O protocolo pode ser interrompido neste ponto, e os núcleos congelados podem ser armazenados a -80 °C. O ciclo de congelamento-descongelamento auxilia na lise subsequente, portanto recomenda-se congelar rapidamente os núcleos mesmo quando se prosseguirá para o Passo 1.3 no mesmo dia.
3. Lise os núcleos e fragmente o DNA.
   1. Descongele os núcleos no gelo e ressuspenda em 500 µL do Tampão B1 pipetando para cima e para baixo. Incube no gelo por 45 min.
   2. Sonicar as amostras seis vezes, por 30 s cada, com amplitude de 40%, usando uma sonda microdica de 3 mm. Coloque as amostras no gelo por 30 s entre cada pulso. Após a sonicação, as amostras devem parecer claras, não turvas.
      OBSERVAÇÃO: As condições de sonicação devem ser otimizadas para cada sonificador específico.
   3. Faça o pellet dos detritos celulares por centrifugação a 14.000 x g por 10 min a 4 °C. O tamanho do pellet deve diminuir significativamente. Filtre o sobrenadante através de um filtro de células de 100 µM e colete o fluxo passante.
   4. Adicione 500 µL do Tampão B2 ao sobrenadante filtrado. Novecentos µL dessa amostra serão usados no Passo 1.4.2.
   5. Retire uma alíquota de cada condição para isolamento de DNA (50 µL ou 1/20 do volume) e adicione 50 µL de solução 2x de dodecilsulfato de sódio (SDS)-bicarbonato [consulte a Tabela de Materiais]. Prossiga para o protocolo de isolamento de DNA.
   6. Retire uma alíquota de cada condição para proteína "input" (50 µL ou 1/20 do volume), adicione 50 µL de tampão amostral 2x de Laemmli, congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.
4. Ligue o DNA biotinilado a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina.
   1. Prepare as esferas magnéticas Streptavidin T1 transferindo 300 µL da suspensão de esferas para um tubo microcêntrifugo de 1,5 mL. Prepare um tubo de esferas por amostra. Lave as esferas três vezes com 1 mL do Tampão B2, agitando em vórtex para ressuspendê-las, aplicando um ímã para separar as esferas e aspirando o tampão de lavagem.
      OBSERVAÇÃO: Condições de ligação otimizadas resultam em rendimento máximo e ligação de fundo mínima. Foi determinado experimentalmente que as esferas magnéticas Streptavidin T1 possuem capacidade de ligação significativamente maior do que esferas de agarose, bem como outras esferas de estreptavidina, e menor ligação de fundo do que as esferas Streptavidin C1 (Figura 1A).
   2. Adicione 900 µL da amostra do Passo 1.3.4 às esferas lavadas e incube em rotação durante a noite a 4 °C.
      Observação: Não agite em vórtex as esferas após adicionar a amostra.
      OBSERVAÇÃO: Se quantidades significativas de DNA ou proteína forem isoladas no controle negativo não marcado, este passo pode ser reduzido de durante a noite para 4 h para reduzir a ligação de fundo.
5. Lave as esferas e elua o vDNA e as proteínas associadas.
   OBSERVAÇÃO: Recomenda-se o uso de ponteiras com filtro nos passos restantes.
   1. Coloque as amostras em um suporte magnético para tubos microcêntrifugos, remova o sobrenadante, ressuspenda suavemente em 1 mL do Tampão B2 e incube em rotação a 4 °C por 5 min.
   2. Repita o Passo 1.5.1 três vezes.
   3. Coloque as amostras em um suporte magnético para tubos microcêntrifugos, remova o sobrenadante, ressuspenda suavemente em 1 mL do Tampão B3 e incube em rotação a 4 °C por 5 min.
   4. Transfira 100 µL da mistura de esferas (1/10 do volume) para um novo tubo para isolamento do DNA ligado. Aplique o tubo ao ímã, remova o sobrenadante, ressuspenda as esferas em 100 µL de solução 1x de dodecilsulfato de sódio (SDS) ou solução SDS-bicarbonato e prossiga para o protocolo de isolamento de DNA.
   5. Aplique o tubo contendo os 900 µL restantes da mistura de esferas do Passo 1.5.3 ao ímã, remova o sobrenadante e ressuspenda as esferas em 50 µL de tampão amostral 2x de Laemmli para eluir proteínas e complexos de DNA-proteína.
   6. Incube as amostras em banho-maria a 95 °C por 15 min, agite em vórtex, centrifugue rapidamente e aplique o ímã. Transfira o eluato para um novo tubo, congele rapidamente e armazene a -80 °C.
      OBSERVAÇÃO: Use as tampas travadas para garantir que os tubos não se abram durante a fervura.
      OBSERVAÇÃO: O protocolo pode ser interrompido neste ponto, e as amostras podem ser armazenadas a -80 °C por várias semanas.
   7. Analise as amostras de proteína por coloração com Azul de Coomassie, Western blot ou espectrometria de massas por procedimentos padrão. Resultados representativos são mostrados nas Figuras 1 e 2.
      OBSERVAÇÃO: Para determinar se o rendimento de proteína é suficiente para espectrometria de massas, 7,5 µL de cada amostra são usados para análise por coloração com Azul de Coomassie e 7,5 µL para Western blot de uma proteína associada ao genoma viral representativa (ICP4, ICP8 ou UL42). O mesmo volume de lisados do Passo 1.3.6 é analisado em paralelo para controle dos níveis de proteína "input". A amostra restante (35 µL) é então analisada por espectrometria de massas.

Resultados

Figura 1: Resultados representativos da purificação de proteínas. (A) Comparação do rendimento proteico quando as etapas de purificação foram realizadas utilizando vários tipos diferentes de microesferas revestidas com estreptavidina. A infecção foi realizada na presença de EdC (+) para comparar o rendimento proteico ou na ausência de EdC (-) para comparar a ligação de fundo. As infecções e a marcação com EdC foram realizadas, e os complexos DNA-proteína foram purificados utilizando quantidades comparáveis de diferentes tipos de microesferas revestidas com estreptavidina. Painel superior: Comparação do rendimento proteico após purificação em microesferas de agarose revestidas com estreptavidina ou Streptavidin M-280. Painel inferior: Comparação do rendimento proteico após purificação em Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 ou Streptavidin T1. A imunomarcação foi realizada com um anticorpo contra a proteína viral ICP4. A ICP4 purificada é mostrada na primeira via para comparação. Foi necessária uma exposição prolongada do painel inferior para observar uma intensidade semelhante de ICP4 na via "280" em relação ao painel superior. (B) Resultados representativos da purificação de proteínas em função do tempo de marcação com EdC são mostrados. As infecções e a marcação com EdC foram realizadas, e os complexos DNA-proteína foram purificados utilizando microesferas Streptavidin T1. A marcação com EdC foi realizada por 0, 20, 40 ou 60 min, e os resultados da coloração com Azul de Comassie (superior) e da imunomarcação (inferior) são apresentados. A imunomarcação foi realizada com anticorpos específicos para ICP4, UL42 ou GAPDH. A amostra do eluato foi coletada na Etapa 1.5.5. e a do lisado na Etapa 1.3.6. A seta indica estreptavidina, enquanto L indica marcador de peso molecular.

Figura 2: Exemplos de diferentes formas de apresentar dados de proteômica. (A) Gráficos de setores circulares resumem as proteínas identificadas por espectrometria de massas em eluatos proteicos associados aos genomas virais purificados às 6 hpi. Os valores indicam o número de proteínas identificadas para cada categoria funcional. T indica o número total de proteínas identificadas. As cores indicam as seguintes categorias: roxo – processamento de RNA, vermelho – transcrição, verde – remodelação da cromatina, laranja – replicação do DNA, amarelo – transporte nuclear, azul-esverdeado – citoesqueleto, azul-escuro – proteínas estruturais do HSV e cinza – outras/desconhecidas. (B) Diagramas de Venn mostram a sobreposição de proteínas identificadas como associadas aos genomas virais às 6, 8 ou 12 hpi. (C) Um mapa STRING exibe proteínas enriquecidas nas forquilhas de replicação viral após um pulso de 5 minutos com EdC. As proteínas humanas enriquecidas em 5 vezes em comparação com o controle negativo não rotulado são mostradas no mapa de interação funcional, gerado utilizando o STRING com configurações de dados para exibir apenas interações de alta confiança. Nomes de genes foram utilizados para mapear as interações. Círculos indicam proteínas que atuam no mesmo processo biológico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células MRC-5	ATCC	CCL-171
Soro bovino fetal (FBS)	Gibco	26140-179
Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)	Gibco	12800-082	Substituído com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 12 mM (para crescimento em frascos) ou 30 mM (para crescimento em placas) de bicarbonato de sódio
Placa de cultura de tecidos de 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
Solução salina tamponada com Tris (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine
Estoque de HSV-1			Estoques com titros superiores a 1x10⁹ PFU/mL apresentam melhor desempenho
Coluna Sephadex G-25 (Coluna de Dessalinização PD-10)	GE Healthcare	17085101
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Etinil-2´-desoxicitidina (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Dissolver em DMSO para preparar estoque de 40 mM, fracionar e armazenar a -20 °C
2´-Desoxicitidina (desoxiC)	Sigma-Aldrich	D3897	Dissolver em água para preparar estoque de 40 mM, fracionar e armazenar a -20 °C
Tampão de extração nuclear (NEB)			Preparar recém (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 300 mM sacarose, 0,5% Igepal)
Escavador celular	Bellco glass	7731-22000	Autoclavar antes do uso
Solução de azul de tripano	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7,2 (10x)			1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ (diluir para 1x em água estéril antes do uso)
Sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO₄·5H₂O)	Fisher Scientific	C489	Preparar estoque de 100 mM e armazenar a 4 °C por até 1 mês
(+) L-ascorbato de sódio	Sigma-Aldrich	A4034	Preparar recém estoque de 100 mM e manter no gelo até o uso
Azida de biotina	Invitrogen	B10184	Preparar estoque de 10 mM em DMSO, fracionar e armazenar a -20 °C por até 1 ano
Mistura da reação de "click"			Preparar imediatamente antes do uso, adicionando os reagentes na ordem indicada (10 mL: 8,8 mL de PBS 1x, 200 mL de CuSO₄ 100 mM, 25 mL de azida de biotina 10 mM, 1 mL de ascorbato de sódio 100 mM)
Cocktail completo de inibidores de protease	Roche	11697498001	Dissolver em 1 mL de água para preparar estoque 50x, pode armazenar a 4 °C por até 1 semana, ou adicionar diretamente 1 comprimido a 50 mL de tampão
Tampão de congelamento			Preparar recém (7 mL de glicerol a 100%, 3 mL de NEB, 200 μL de inibidor de protease 50x)
Tampão B1			Preparar recém (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, inibidor de protease 1x)
Tampão B2			Preparar recém (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% Igepal, inibidor de protease 1x)
Tampão B3			Preparar recém (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, inibidor de protease 1x)
Processador ultrassônico Vibra Cell equipado com sonda microtip de 3 mm	Sonics	VCX 130
Filtro celular	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidina T1	Life Technologies	65601
Ímã DynaMag-2	Life Technologies	12321D
Rotador de microtubos	Fisher Scientific	260750F
Tampão amostra 2x Laemmli			Misturar 400 mg de SDS, 2 mL de glicerol a 100%, 1,25 mL de Tris 1 M (pH 6,8) e 10 mg de azul de bromofenol em 8 mL de água. Armazenar a 4 °C por até 6 meses. Antes do uso, adicionar DTT 1 M para uma concentração final de 200 mM.
Tampas para tubos de 1,5 mL	Fisher Scientific	NC9679153
Reagentes padrão para western blot
Kit de coloração azul coloidal NOVEX	Invitrogen	LC6025
Placa de cultura de tecidos de 12 poços	Corning	3513
Cobrimentos	Fisher Scientific	12-545-100	Autoclavar antes do uso
Lâminas para microscopia	Fisher Scientific	12-552-5
Paraformaldeído a 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluir para 3,7% em PBS 1x antes do uso
Albumina sérica bovina (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	Preparar 3% em PBS 1x
Tampão de permeabilização (0,5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	Preparar 0,5% de Triton-X 100 em PBS 1x
Cocktail da reação de "click" - Kit Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging	Molecular Probes	C10337	Preparar de acordo com o protocolo do fabricante
Solução 2x SDS-bicarbonato			2% SDS, 200 mM NaHCO₃
Tris EDTA (TE) 10x, pH 8,0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (diluir para 1x antes do uso)
Microcentrífuga para tubos de 1,5 mL
Centrífuga de bancada para tubos de 15 e 50 mL
Incubadora de cultura celular
Cabinet de segurança biológica
Blocos térmicos			65 °C e 95 °C