Um dispositivo revestido de silicone impresso em 3D para modelar a infecção do trato urinário associada ao cateter

Resumo

Fonte:
Ocean E. Clarke¹, Romy A. Dop¹, Tom Hasell¹, Joanne L. Fothergill¹, Daniel R. Neill<sup>2

1</sup>Universidade de Liverpool, ² Universidade de Dundee

Este vídeo demonstra o uso de um dispositivo revestido de silicone impresso em 3D que imita a superfície interna dos cateteres urinários para simular a infecção do trato urinário associada ao cateter.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Fabrico aditivo de modelos Flexipeg

1. Imprima pinos (24 pinos necessários por tampa de pino) e tampas de pinos em resina estável a alta temperatura usando estereolitografia (100 μm de altura da camada).
   NOTA: A resina estável de alta temperatura é utilizada para pinos, e as tampas dos pinos podem ser esterilizadas em autoclave antes da experimentação.
2. Imprima em 3D os componentes do molde e as partes do rack do tubo de ensaio usando modelagem de deposição fundida (FDM) com 60% de preenchimento.
   NOTA: Qualquer resina durável é adequada para FDM, pois moldes e racks de tubos de ensaio podem ser esterilizados com etanol e não requerem estabilidade em altas temperaturas.
3. Certifique-se de que os componentes do modelo foram impressos corretamente e remova qualquer excesso de resíduo do processo de impressão usando etanol a 70%.
4. Monte o molde do tapete de silicone conforme mostrado na Figura 1, segurando as laterais no lugar com fita adesiva, se necessário.

2. Preparação do modelo Flexipeg

1. Preparação de tapete de silicone
   1. Pesar 18 g de base de silicone (base 10:1 para catalisador polidimetilsiloxano (PDMS), cura por condensação) em um béquer e misturar delicadamente 2 g de catalisador até incorporar bem.
      NOTA: Evite agitar excessivamente a mistura de silicone para evitar a formação de bolhas dentro do molde.
   2. Despeje a mistura de silicone combinada no molde impresso em FDM, limpando o excesso de mistura de silicone das laterais e da parte superior do molde. Deixar catalisar durante a noite (mínimo de 18 h) à temperatura ambiente (RT).
   3. Remova o tapete do molde e apare o excesso de silicone das laterais. Certifique-se de que o tapete se encaixa na tampa do pino, conforme mostrado na Figura 1.
2. Revestimento de pinos
   1. Insira os pinos em um tapete de silicone (24 pinos por tapete) e prenda o tapete na tampa do pino ou em uma bandeja plástica de dimensões semelhantes às do tapete usando fita adesiva.
   2. Pese 27 g de base de silicone em uma bandeja de plástico rasa (aproximadamente as mesmas dimensões de uma placa de 96 poços) e misture bem 3 g de catalisador até incorporar bem.
   3. Inverta as tampas dos pinos de forma que fiquem voltadas para baixo e mergulhe imediatamente os pinos na mistura de silicone. Inverta a tampa do pino e deixe o excesso de silicone escorrer pelos pinos e os pinos curarem durante a noite em temperatura ambiente.
      NOTA: O silicone de cura rápida (6-8 h de cura completa; 40-60 min de tempo de trabalho) continuará a pingar/fluir antes da cura; portanto, não é imperativo revestir todo o pino no PDMS ao mergulhar, pois qualquer excesso revestirá o resto do pino durante a cura.
   4. Depois de curado, repita as etapas 2.2.2 a 2.2.3. até que as estacas tenham sido revestidas três vezes em PDMS. Certifique-se de que a primeira camada de revestimento esteja completamente curada antes de prosseguir para a segunda etapa de revestimento.
      NOTA: Os revestimentos finais dos pinos devem ter <2 mm de espessura, sem imperfeições visíveis. Se o silicone permanecer pegajoso após a incubação durante a noite em RT, deixe-o curar por 24 horas e descarte os revestimentos se os pinos ainda estiverem pegajosos ao toque.
   5. Usando um bisturi estéril, apare ao redor da base dos pinos revestidos de silicone (o mais próximo possível da parte inferior) para remover os pinos da configuração do revestimento.
      NOTA: Este processo deve ser repetido até que o número desejado de pinos e tapetes de silicone seja preparado. O excesso de PDMS usado no processo de revestimento de pinos pode ser usado para fundir novos tapetes de silicone antes da cura.
3. Configuração do modelo
   1. Insira os pinos revestidos no tapete de silicone e prenda o tapete na tampa do pino, conforme mostrado na Figura 1.
   2. Cubra a parte inferior da tampa do pino/tapete de silicone (preso à base do pino) com fita autoclavável para manter os pinos no lugar. Coloque a configuração da tampa do pino em um saco autoclavável lacrado e esterilize em autoclave antes de usar.
      NOTA: Os pinos na tampa do pino se encaixam em uma placa de 96 poços em uma orientação singular. Depois de colar a configuração do pino, verifique o alinhamento dos pinos em uma placa sobressalente de 96 poços e rotule a fita da autoclave de acordo com a orientação correta da tampa.

3. Inoculação de modelos

1. Preparação da cultura bacteriana
   1. Prepare culturas durante a noite de isolados bacterianos em teste, suspendendo um loop cheio de colônias bacterianas cultivadas em meio sólido em 10 mL de caldo Luria-Bertani (LB). Incubar durante a noite (18 h) a 37 °C com agitação.
      NOTA: Recomenda-se um mínimo de três réplicas biológicas para uso no modelo de biofilme Flexipeg.
   2. Normalize as culturas para uma DO_{de 600 nm}de 0,1 (aproximadamente 10⁸ unidades formadoras de colônias (UFC) / mL após a diluição da placa) em um volume final de 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Configuração e inoculação de microplacas
   1. Alíquota de 135 μl de urina humana (PHU) acumulada em cada alvéolo de ensaio numa placa de 96 poços, de acordo com a disposição da placa na figura 1 (8). Cada poço representa um replicado técnico (são necessários um mínimo de n = 3 replicates técnicos por replicado biológico).
      NOTA: Meios de urina artificial (AUM) podem ser utilizados em vez de PHU, se desejado pelo usuário.
   2. Inocular cada poço de teste com 15 μL da cultura noturna normalizada, resultando em um volume final do poço de 150 μL. Reservar pelo menos 100 μL de cultura noturna normalizada para diluições seriadas para validar a UFC/mL do inóculo.
   3. Preparar controlos negativos aliquotando 150 μL de PHU estéril apenas nos alvéolos relevantes.
   4. Após a configuração da microplaca, insira os pinos em seus respectivos poços (conforme determinado antes da esterilização dos pinos em autoclave) e certifique-se de que a tampa do pino esteja nivelada com a superfície da placa. Cubra a tampa do pino com a tampa da microplaca, segurando-a no lugar com fita adesiva, se necessário.
   5. Coloque os modelos de pinos em uma cuba/saco plástico selado com anúncioamp rolo azul para evitar a evaporação e incube estaticamente por 24 h a 37 °C.
3. Validação de inóculo
   1. Alíquota de 180 μL de PBS nas fileiras 2-6 da primeira coluna de uma microplaca de 96 poços e adicione os 100 μL reservados de cultura normalizada durante a noite no primeiro poço.
   2. Remova 20 μL da cultura normalizada durante a noite do primeiro poço e alíquota no segundo poço, pipetando suavemente para cima e para baixo para misturar.
   3. Repetir o passo 3.3.2 até que o inóculo inicial tenha sido diluído até ao alvéolo final (1 × 10⁵).
   4. Colocar manchas de 10 μl de cada diluição em meio sólido adequado em triplicado. Incubar estaticamente durante a noite a 37 °C.
   5. Após a incubação, conte o número de colônias em cada local para calcular a UFC/mL real do inóculo.

4. Quantificação de biofilme

1. Processamento de peg
   1. Após a incubação, remova o modelo de pino da microplaca e inverta-o sob uma chama ou dentro de um gabinete de segurança microbiana (pinos voltados para cima). Descarte as microplacas.
   2. Transfira a tampa do pino para uma nova microplaca contendo alíquotas de 180 μL de PBS estéril para remover quaisquer células não aderidas. Repita duas vezes em PBS fresco para um total de três etapas de lavagem.
      NOTA: Para evitar danos aos biofilmes associados à superfície, evite interromper os pinos ao remover a tampa do pino de cada microplaca (ou seja, tocar nas bordas do poço).
2. Enumeração UFC/mL (associada ao biofilme)
   1. Trabalhando assepticamente sob uma chama ou em um gabinete de segurança microbiológica, configure o rack de tubos (fabricado na etapa 1.2.) com tubos de ensaio de vidro estéril conforme mostrado na Figura 1 e prenda a parte superior do rack que se encaixa na tampa do pino.
   2. Assepicamente, alíquota de 600 μL de PBS estéril em cada tubo de ensaio.
   3. Coloque a tampa do pino no rack, com os pinos alinhados com os tubos no rack. Remova qualquer fita de autoclave na tampa do pino.
   4. Usando uma pinça estéril, empurre os pinos através da tampa do pino e nos tubos de ensaio correspondentes alinhados abaixo.
   5. Recoloque as tampas dos tubos e bata cada tubo por 60 s para desagregar as células associadas ao biofilme da superfície do pino.
   6. Remova 100 μL de cada tubo e dilua seriamente, conforme descrito anteriormente na etapa 3.3 em PBS estéril.
   7. Com uma pipeta serológica, colocar 10 μl de cada diluição em meio sólido adequado e incubar estaticamente a 37 °C durante a noite.
   8. Após a incubação, contar o número de colónias em cada placa de diluição e utilizá-lo para calcular o UFC/ml.
3. Coloração violeta de cristal
   1. Alíquota de 180 μL de cristal violeta a 0,1% (p/v) (em água estéril) nos 24 poços em teste de uma microplaca de 96 poços.
   2. Insira o modelo de pino enxaguado (pinos e tampa do pino) nos poços correspondentes da microplaca. Incubar estaticamente à temperatura ambiente durante 20 min.
   3. Após a incubação, remova o modelo de pino da microplaca e descarte a microplaca.
   4. Em uma cuba de tamanho apropriado, enxágue todo o pino em água da torneira enquanto agita suavemente. Repita três vezes.
   5. Inverta o modelo de pino e deixe os pinos secarem completamente em RT.
   6. Alíquota de 180 μL de ácido acético a 30% em uma microplaca nova de 96 poços e insira o modelo de pino seco nos poços correspondentes. Incubar em RT por 30 min.
   7. Remova o modelo de pino da microplaca e leia OD_540nm dos poços corados usando um leitor de microplacas ou espectrofotômetro.
   8. Para calcular a formação de biofilme em pinos, calcule a média de_{540 nm do OD 540}

Resultados

Figura 1: Uma representação esquemática da configuração do modelo Flexipeg. (1) Um único Flexipeg, revestido com polidimetilsiloxano (PDMS) para replicar a superfície do cateter urinário para a formação de biofilme. (2) O dispositivo de biof...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microplacas de 96 poços	Greiner	650161	Parte inferior em forma de U/redonda.
Ácido acético	SLS	695092-2.5LSIG	≥ 99,7% de reagente ACS.
Violeta de cristal	Merck	61135-25G
Peg individual	Internamente	Componentes Flexipeg a serem impressos em 3D	Fabricação aditiva usando resina estável a altas temperaturas (24 pinos necessários por modelo Flexipeg). Fabricado com resina de alta temperatura Formlabs da Protolabs (NL).
Caldo Luria-Bertani (LB)	Neogen	NCM0088B	Caldo LB (Miller).
Tampa que se encaixa em uma placa de 96 poços	Internamente	Componentes Flexipeg a serem impressos em 3D	Fabricação aditiva usando resina estável a altas temperaturas.
Molde para preparar tapete de silicone	Internamente	Componentes Flexipeg a serem impressos em 3D	Fabricação aditiva de qualquer material durável. Fabricado com resina de prototipagem ABS da Protolabs (NL).
Molde para preparar o lado do tapete de silicone	Internamente	Componentes Flexipeg a serem impressos em 3D	Fabricação aditiva de qualquer material durável.
Solução salina tamponada com fosfato	Merck	P4417-50TAB
Urina humana acumulada	-	-	Coletado de doadores saudáveis após aprovação ética pelo comitê de ética em pesquisa da universidade central.
Rack para tubos de vidro	Internamente	Componentes Flexipeg a serem impressos em 3D	Fabricação aditiva de qualquer material durável.
Silicone (PDMS)	MB Fibra de Vidro	GP3481-F	Borracha de silicone da cura da cura da condensação de uso geral RTV de Polycraft.
Top que se encaixa na tampa do pino	Internamente	Componentes Flexipeg a serem impressos em 3D	Fabricação aditiva usando resina estável a altas temperaturas.
Cateteres de Foley	Grande Urso Saúde Reino Unido Ltda		14 ch, 100% silicone