Purificação de Vetores Adenovirais Contendo Genoma Baseada em Cloreto de Césio

Neste artigo

Resumo

Fonte: Ehrke-Schulz, E., et al. Clonagem e Produção em Grande Escala de Vetores Adenovirais de Alta Capacidade Baseados no Adenovírus Humano Tipo 5. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a purificação de vetores adenovirais de alta capacidade utilizando ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio, permitindo a separação de viriões contendo genoma para aplicações na entrega gênica, caracterização de vetores e estudos terapêuticos pré-clínicos

Protocolo

Purificação e Diálise de HCAdV (vetores adenovirais de alta capacidade)
1. Para preparar o lisado viral para gradientes de cloreto de césio (CsCl), congele a suspensão de células e vírus em nitrogênio líquido e descongele em banho-maria a 37 °C por 4 ciclos.
2. Centrifugue o lisado viral a 500 x g durante 8 min à temperatura ambiente (RT) e colete o sobrenadante contendo o HCAdV (vetores adenovirais de alta capacidade).
3. Para ultracentrifugação, prepare soluções de CsCl da seguinte forma: pese 37,5 g (para 1,5 g/cm³), 33,5 g (para 1,35 g/cm³) e 31,25 g (para 1,25 g/cm³) de pó de CsCl, respectivamente, e complete com dH₂O até 25 ml.
  1. Agite até que a solução fique límpida e filtre esterilmente as soluções. Por fim, retire 1 ml de cada solução e pese em uma balança de precisão para verificar se a densidade está correta. 1 ml deve pesar 1,5 g, 1,35 g e 1,25 g, respectivamente.
  2. Se a densidade for muito alta, ajuste-a pela adição gradual de pequenos volumes (µl) de dH₂O estéril. Após a adição de dH₂O, meça novamente a densidade. Se necessário, adicione mais dH₂O.
  3. Repita o procedimento até que a densidade esteja correta. Se a densidade for muito baixa, ajuste-a adicionando uma pequena quantidade de pó de CsCl. Filtre esterilmente novamente e verifique a densidade. Se a densidade ainda estiver muito alta, ajuste-a adicionando dH₂O conforme descrito anteriormente. Se a densidade ainda estiver muito baixa, adicione mais CsCl, filtre esterilmente novamente e verifique a densidade. Repita o procedimento até que a densidade esteja correta.
4. Prepare gradientes em etapas de CsCl em 6 tubos de ultracentrífuga transparentes. Pipete cuidadosa e lentamente as soluções de CsCl nos tubos na seguinte ordem: 0,5 ml de solução de CsCl a 1,5 g/cm³, 3 ml de solução de CsCl a 1,35 g/cm³ e 3,5 ml de solução de CsCl a 1,25 g/cm³ (Figura 1C).
5. Sobreponha aproximadamente 4,5 ml do sobrenadante clarificado do vetor do passo 1.2 sobre a camada de CsCl a 1,25 g/cm³. Centrifugue os gradientes em uma ultracentrífuga usando um rotor oscilante (SW-41) a 12 °C por pelo menos 2 h a 226.000 x g (35.000 rpm), com aceleração e desaceleração lentas, para separar partículas virais contendo genoma HCAdV de partículas vazias e detritos celulares.
  NOTA: Em condições ideais, forma-se uma faixa difusa de detritos celulares na parte superior dos tubos. Abaixo, podem ser observadas duas faixas brancas. A faixa superior contém partículas vazias, enquanto a faixa inferior corresponde ao HCAdV (Figuras 1C e 2A).
6. Remova cuidadosamente as camadas de detritos celulares e partículas vazias e colete 1 ml da faixa inferior de cada tubo, transferindo o vírus com uma ponteira limpa para um tubo estéril de 50 ml. Complete com até 24 ml de solução de CsCl a 1,35 g/cm³ as partículas virais coletadas e misture cuidadosamente.
7. Encha os tubos de centrífuga com a solução de vírus em CsCl a 1,35 g/cm³ até o topo e centrifugue O/N (durante a noite) (18–20 h) a 226.000 x g (35.000 rpm) a 12 °C em uma ultracentrífuga usando um rotor oscilante (SW-41), com aceleração e desaceleração lentas.
8. Colete o HCAdV presente na faixa inferior proeminente. Como uma faixa superior potencial pode conter partículas vazias, remova as camadas superiores a partir do topo usando uma pipeta (veja Figuras 1C e 2B). Em seguida, retire a faixa inferior usando uma pipeta.
9. Diализe as partículas virais coletadas para troca de tampão.
  1. Corte uma tira de tubo de diálise (MWCO: 50.000) com cerca de 8 cm de comprimento, lave-a com dH₂O estéril por 3 vezes. Em seguida, feche um lado do tubo de diálise com um grampo plástico e transfira o vírus coletado do passo 5.8 para o tubo usando uma pipeta de 1 ml. Evite bolhas de ar dentro do tubo e feche o outro lado com um grampo plástico de fechamento para diálise.
  2. Realize a diálise em 1 L de tampão de diálise (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% glicerol e 1 mM MgCl₂ (cloreto de magnésio) em H₂O desionizada) por 2 h a 4 °C com agitação lenta. Substitua o tampão de diálise por 2 L de tampão de diálise e continue a diálise O/N a 4 °C com agitação lenta. Alternativamente, utilize um tampão de sacarose (140 mM NaCl (cloreto de sódio), 5 mM Na₂HPO₄·2H₂O (fosfato de dissódio), 1,5 mM KH₂PO₄ (fosfato de potássio diácido) e 730 mM sacarose, pH 7,8).
  3. Colete as partículas virais diализadas do passo 1.9.2 usando uma pipeta de 1 ml. Prepare múltiplos alíquotas em volumes pequenos desejados (25–100 µl) e armazene o vírus purificado a -80 °C.

Resultados

Figura 1. Resultados representativos do procedimento de clonagem e liberação do genoma do HCAdV (vetores adenovirais de alta capacidade) a partir do pAdVFTC. (A) Liberação da cassete de expressão do gene de interesse (GOI) do pHM5 mediante digestão com PI-SceI e I-CeuI. (B) Cassete de expressão do GOI purificada e pAdVFTC purificado e desfosforilado, digerido com PI-SceI e I-CeuI, respectivamente. (C) Digestão analítica com HincII de clones do pAdVFTC com e sem o GOI. (D) Liberação do genoma do HCAdV contendo o GOI a partir do pAdVFTC-GOI mediante digestão com NotI

Figura 2. Resultados representativos após gradiente de cloreto de césio (centrifugação em gradiente de CsCl (A) Após realizar um gradiente em etapas (ver também o passo 1.5); (B) Após gradiente contínuo (ver também o passo 1.7).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos ultraclaros para ultracentrífuga	Beckmann Coulter	344059	centrifugação em gradiente de densidade
Ultracentrífuga	Beckmann Coulter		centrifugação em gradiente de densidade
Rotor SW-41	Beckmann Coulter		centrifugação em gradiente de densidade
Membrana Spectrapor da Spectrum Laboratories	VWR	132129	tubo de diálise
Cassetes de diálise prontos para uso	Thermo	66383	diálise
Cloreto de césio	Carl Roth	8627.1	centrifugação em gradiente de densidade
Meio LB	Carl Roth	X968.3	meio de crescimento bacteriano
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	tampão de diálise/tampão de lise
Glicerol 99,5%	Carl Roth	3783.1	tampão de diálise
MgCl₂ 98,5%	Carl Roth	KK36.2	tampão de diálise opcional
NaCl	Carl Roth	3957.1	tampão de diálise opcional
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	tampão de diálise opcional
Sacarose	Carl Roth	9286.1	tampão de diálise opcional
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	tampão de diálise opcional
Tubos de 1,5 ml	sarstedt	72,730,005	armazenamento de preparações virais a -80 °C