O vídeo demonstra um método para injeção intramiocárdica guiada por ultrassom de um vetor viral recombinante em um modelo de camundongo. Esta técnica permite a entrega direcionada de genes ao coração para estudar os efeitos da expressão de transgenes na função cardíaca.
Artigo de método
Entrega de Genes Virais no Coração de Camundongos para Avaliação dos Efeitos Gênicos na Função Cardíaca
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31 de agosto de 2026
Neste artigo
Resumo
Protocolo
1. Expressão viral de transgénio em tecidos ventriculares de roedores
NOTA: Armazene o adenovírus recombinante ou o vírus adeno-associado (AAV) que expressa o gene alvo e o vírus controle correspondente, como Ad-GFP (proteína verde fluorescente) (título de 1 x 1010 unidades formadoras de placas [PFU]/mL) ou AAV9-GFP (título de 1 x 1013 cópias genômicas [GC]/mL) (consulte a Tabela de Materiais), em um congelador a −80 °C.
- No dia da injeção do vírus, descongele o vírus em gelo. Aspire o vírus que expressa o gene alvo e o vírus controle em duas seringas separadas (volume = 50 µL) com agulhas 30 G ½ e mantenha em gelo até o uso.
NOTA: Todas as bolhas na seringa e na agulha devem ser cuidadosamente removidas. - Administre buprenorfina a ratos ou camundongos (0,05 mg/kg para ratos, 0,1 mg/kg para camundongos, via subcutânea), uma hora depois, induza anestesia com 3% de isoflurano e mantenha o isoflurano em 2% (em oxigênio a 100% com fluxo de 0,5-1,0 L/min) para o procedimento subsequente.
- Pince suavemente o corpo do animal (por exemplo, a cauda) com um par de pinças, e se o animal não responder ao estímulo com qualquer movimento corporal, a anestesia adequada está confirmada.
- Mantenha a temperatura corporal a 37 °C utilizando um tapete aquecedor elétrico. Remova os pelos da região torácica utilizando uma máquina de cortar cabelo.
NOTA: Deve-se ter cuidado ao usar um tapete aquecedor elétrico devido à possível distribuição desigual de calor. - Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para prevenir o ressecamento da córnea.
- Mantenha o animal em posição supina e utilize um sistema de imagem pré-clínica (veja a Tabela de Materiais) para a imagem ultrassonográfica do coração do animal na orientação de eixo curto.
NOTA: Os passos seguintes são realizados em uma cabine de segurança biológica nível II, que fornece um ambiente estéril. Procedimentos padrão de segurança, incluindo manuseio seguro de agulhas, são empregados. - Esterilize a região inferior esquerda do tórax do animal com rodadas alternadas de antisséptico à base de iodo ou clorexidina e álcool, três vezes, em movimento circular.
- Sob orientação de imagem ultrassonográfica, insira a agulha 30 G 1/2 da seringa contendo o vírus preparado no passo 1.1. no tórax do animal através do lado inferior esquerdo do corpo.
- Posicione a ponta da agulha na parede anterior livre do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10-15 μL do vírus. Verifique a injeção bem-sucedida nas imagens ultrassonográficas pela maior intensidade de brilho próxima à ponta da agulha.
NOTA: A quantidade de vírus injetada em cada local não deve exceder 15 μL para prevenir danos físicos aos tecidos miocárdicos. - Retire a agulha do coração e insira-a em outras regiões do ventrículo esquerdo para uma segunda e terceira injeção da mesma quantidade de vírus.
NOTA: O número total de locais de injeção é determinado pelo desenho experimental. Se for necessária expressão focal do transgene, apenas uma injeção é suficiente; se for necessária expressão mais difusa do transgene, geralmente são necessários múltiplos locais de injeção (três a cinco). - Após a conclusão das injeções, devolva o animal à sua gaiola.
- Monitore cuidadosamente o animal até que ele recupere consciência suficiente para manter a decúbito esternal e devolva-o à sala de alojamento.
- Administre cloridrato de buprenorfina (0,1 mg/kg, duas vezes ao dia para camundongos, 0,05 mg/kg, duas vezes ao dia para ratos, via subcutânea) ao animal pelos próximos 2 dias. Devolva os animais ao biotério e monitore diariamente quaisquer sinais incomuns de dor ou sofrimento, e, se detectados, trate os animais conforme os protocolos do comitê institucional de cuidados com animais.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulha PrecisionGlide 30 G ½ | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| Vírus adeno-associado (AAV9 que expressa proteína verde fluorescente [GFP]) | Vector Biolabs | 7007 | |
| Adenovírus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| Capa de biossegurança (Nível II) | Microzone Corporation | N/A | Modelo #: BK-2-4 |
| Buprenorfina | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Aparelho de barbear | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Seringa Hamilton | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Almofada aquecida | Life Brand | E12107 | |
| Isóflurano | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Camundongos (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Camundongos (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Pomada oftálmica | Systane | DIN 02444062 | |
| Ratos (Sprague-Dawley, macho) | Charles River | 400 | |
| Lâminas de bisturi | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Empunhadura de bisturi | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Sistema de Imagem Pré-clínica VEVO3100 | VisualSonic Inc. | N/A |
