Transdução de um Fígado de Rato Humanizado Utilizando Vetores de Vírus Adeno-associados

Resumo

Fonte: Hiller, T., et al. Estudo de Vetores Virais em um Modelo de Fígado Tridimensional Repovoado com a Linhagem Celular de Carcinoma Hepatocelular Humano HepG2. J. Vis. Exp., (2016)

Este vídeo demonstra a entrega de genes mediada por vírus adeno-associado em um esqueleto de fígado de rato humanizado. O vetor entrega um transgene que codifica um repórter fluorescente e um RNA de silenciamento gênico em células hepáticas por meio de endocitose mediada por receptor. Este modelo permite uma transdução eficiente em um sistema de tecido hepático tridimensional com perfusão.

Protocolo

Transdução do Modelo de Fígado

1. Ajuste a solução do vetor de vírus adeno-associado (AAV) para uma concentração final de 2,7 x 10¹³ genomas virais em 5 ml, adicionando o volume respectivo de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Desconecte o fígado do circuito de meio removendo a tubulação da cânula. Conecte uma seringa de 5 ml à cânula da veia porta e injete toda a solução do vetor AAV (5 ml).
3. NOTA: Opcionalmente, adicione vermelho de fenol (5 µg/ml) para acompanhar a distribuição da solução do vetor AAV por todo o fígado.
4. Incube por 1 hora sem bombeamento. Aumente gradualmente a taxa de fluxo, iniciando com 1,25 ml/min por 10 min; 2,5 ml/min por 20 min e 3,75 ml/min por 30 min. Cultive o fígado de rato recelularizado por 6 dias.
5. NOTA: Substitua um terço do meio por meio fresco (50 ml) a cada dois dias. Colete amostras do meio de cultura para medir parâmetros fisiológicos, como atividade da lactato desidrogenase, o pH das amostras de meio e a concentração de glicose e lactato.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora	Fraunhofer	/
Bomba peristáltica	Fraunhofer	/
Flange com ranhura	Duran	2439454
O-Ring transparente	Duran	2922551
Abraçadeira de liberação rápida	Duran	2907151
Tampa plana de flange	Duran	2429857
Tubo com rosca	Duran	2483802
Tubo com rosca	Duran	2483602
Anel de vedação de silicone	Duran	2862012
Tampa rosqueável	Duran	2924013
Tampa rosqueável	Duran	2924008
Tampa rosqueável com abertura	Duran	2922709
Tampa rosqueável com abertura	Duran	2922705
Filtro	Sarstedt	831,826,001
Tubo de silicone	VWR	228-1500
Conector de tubo	Ismatec	ISM556A
Tubo biocompatível	Ismatec	SC0736
Frascos de cultura T175	Greiner bio-one	660 160
RPMI 1640	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0501-500
glutamina	BioWest SAS (Th. Geyer)	X0551-100
Tripsina	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0940-100
penicilina/estreptomicina	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0022-100
soro fetal bovino	cc pro	S-10-M
HepG2	DSMZ	ACC 180