Confirmação da Transdução Viral em Fígado de Rato Recelularizado Utilizando Coloração Imunohistoquímica

Resumo

Fonte: Hiller, T. et. al. Estudo de Vetores Virais em um Modelo de Fígado Tridimensional Repovoado com a Linhagem Celular de Carcinoma Hepatocelular Humano HepG2. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a coloração imunohistoquímica para avaliar a transferência gênica viral em um modelo de fígado de rato recelularizado. A expressão do gene repórter, confirmada pela detecção com anticorpos e co-localização com a coloração nuclear, indica transdução viral bem-sucedida nas células.

Protocolo

1. Transdução do Fígado de Rato Recelularizado

1. Produção em Grande Escala de vetor viral derivado de vírus adeno-associados (vetor AAV)
   1. Produzir, purificar e quantificar vetores AAV:
      1. Resumidamente, produza vetores AAV em frascos rotativos e purifique-os por centrifugação em gradiente de iodixanol. Remova o iodixanol residual por filtração em colunas de filtração em gel PD10. Determine a concentração do vetor AAV por reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), utilizando DNA genômico de AAV como padrão.
         NOTA: O vetor AAV2/6 pseudotipado auto-complementar utilizado no presente estudo codificava a proteína fluorescente verde esmeralda, EmGFP, como marcador para demonstrar a eficiência de transdução e um cassete de expressão de RNA de interferência em formato de alça curta (shRNA) para o silenciamento de um gene expresso endogenamente (ciclofilina B humana (hCycB), Figura 1). Garanta uma quantidade suficiente de vetores scAAV pseudotipados do sorotipo 6 (2,7 x 10¹³ genomas virais por modelo de fígado).
2. Transdução do Modelo de Fígado
   1. Ajuste a solução do vetor AAV para uma concentração final de 2,7 x 10¹³ genomas virais em 5 mL, adicionando o volume correspondente de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   2. Desconecte o fígado do circuito de meio removendo o tubo da cânula. Conecte uma seringa de 5 mL à cânula da veia porta e injete toda a solução do vetor AAV (5 mL).
      NOTA: Opcionalmente, adicione vermelho de fenol (5 µg/mL) para acompanhar a distribuição da solução do vetor AAV por todo o fígado.
   3. Incube por 1 hora sem bombeamento. Aumente gradualmente a taxa de fluxo, iniciando com 1,25 mL/min por 10 minutos; 2,5 mL/min por 20 minutos e 3,75 mL/min por 30 minutos. Cultive o fígado de rato recelularizado por 6 dias.

2. Avaliação do Fígado de Rato Recelularizado e Transduzido

1. Coloração com hematoxilina e eosina (HE) e Análise imunohistoquímica
   1. Coletar amostras (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) de cada lobo hepático utilizando um bisturi.
   2. Incubar as amostras em solução de paraformaldeído a 4% (PFA) + sacarose a 4% por 1,5 h a 4 °C. (Cuidado: o PFA é tóxico e carcinogênico. Manuseie sempre dentro de uma cabine de segurança e use roupas de proteção adequadas.) Lavar três vezes com PBS (1 min por etapa de lavagem) e incubar em sacarose a 8% durante a noite a 4 °C.
   3. Despejar o meio de fixação em moldes plásticos para criomoldagem e colocar as amostras no meio de fixação, livres de bolhas de ar. Adicionar meio de fixação até que a amostra esteja bem coberta. Armazenar as amostras embutidas a -80 °C até uso posterior.
   4. Preparar cortes criostáticos (10 µm) com um criostato. Avaliar a recelularização por coloração com hematoxilina + eosina. Avaliar a eficiência de transdução por coloração imunohistoquímica para o gene de interesse (neste caso: EmGFP).

Resultados

Figura 1. Mapa do vetor AAV2/6 pseudotipado auto-complementar utilizado no presente estudo. O genoma consiste nas repetições terminais invertidas (ITR) do AAV2 e codifica EmGFP sob controle do promotor CMV, bem como um shRNA sob controle de um promotor U6.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tissue-Tek O.C.T.	Weckert-Labortechnik	600001
Cryomold 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566
Incubadora	Fraunhofer	/