Este vídeo demonstra a geração de linhagens celulares tumorais com silenciamento condicional usando um sistema de shRNA lentiviral induzível por Tet. Ele descreve os passos para transdução viral, seleção com antibiótico e silenciamento gênico induzido por doxiciclina.
Artigo de método
Geração de Células com Knockdown Condicional Utilizando um Sistema de Expressão Lentiviral de shRNA Responsivo à Tetraciclina
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31 de agosto de 2026
Neste artigo
Resumo
Protocolo
- Geração de linhagens celulares transduzidas de forma estável
- Plante células de câncer de cólon HCT116 e células de câncer de mama MDA-MB-231 a 50.000 células/poço em meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) em uma placa de 12 poços. Incube a 37 °C e 5% de CO2 até que as células atinjam 60 - 70% de confluência.
- Lave as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicione 1 mL de meio contendo vírus às células cancerígenas e incube durante a noite a 37 °C e 5% de CO2. Como controle, adicione 1 mL de meio DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de Pen/Strep a 2 poços com células cancerígenas.
- Remova cuidadosamente o meio contendo vírus por aspiração. Lave as células com PBS e troque o meio para DMEM com 10% (v/v) de FBS livre de tetraciclina (Tet-free) e 1% de Pen/Strep.
- Após 72 h, lave as células com PBS e troque o meio para DMEM com 10% de FBS Tet-free, 1% de Pen/Strep e 1 µg/mL de puromicina para seleção das células transduzidas com vírus.
- Dependendo da linhagem celular utilizada, ajuste a concentração de puromicina para seleção ideal testando uma faixa de concentrações de puromicina (0,1, 0,5, 1, 2 e 5 µg/mL) em células não transduzidas e escolhendo a menor concentração na qual nenhuma célula controle sobreviva após 3 dias de cultivo.
- Selecione as células transduzidas com vírus cultivando-as na presença de puromicina por 3 - 14 dias. Como controles, prepare dois poços adicionais com células não transduzidas, um com meio contendo puromicina e outro sem puromicina. Observe a morte parcial das células pela puromicina no poço com células transduzidas com vírus em comparação com os poços controle.
NOTA: Células não transduzidas não crescerão na presença de puromicina. - Verifique a eficiência do silenciamento condicional (KD) nas células de câncer de cólon HCT116 e de câncer de mama MDA-MB-231 resistentes à puromicina.
NOTA: A concentração eficaz de doxiciclina variará conforme a linhagem celular utilizada e deve ser titulada (tipicamente entre 100 ng/mL e 2 µg/mL).- Determine a concentração de doxiciclina que não seja tóxica para as células, mas eficaz na redução da expressão da proteína de interesse. Neste protocolo, 1 µg/mL foi utilizada com sucesso in vitro.
- Cultive as células por 72 h na presença e ausência de 0,1, 1 e 2 µg/mL de doxiciclina. Verifique o nível de expressão da proteína silenciada (neste caso, inibidor-1 do ativador do plasminogênio (PAI-1)) no lisado celular por meio de análise de Western blot. Compare as células HCT116 e MDA-MB-231 que expressam condicionalmente RNA de interferência em formato de alça curta (shRNA) com células controle com sequência aleatória.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Vetor lentiviral Tet-pLKO-puro | Addgene | 21915 | |
| FBS (livre de tetraciclina) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Vetor psPAX | Addgene | 12260 | |
| Vetor pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Células HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Puromicina | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxiciclina hialonato | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Instituto Roswell Park Memorial (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 |
