Preparação de Suspensão Enriquecida com Vírus Utilizando Centrifugação em Gradiente Escalonado de Sacarose

Resumo

Fonte: Vijayraghavan, S. e Kantor, B. Um Protocolo para a Produção de Vetores Lentivirais Deficientes em Integrase para Inativação Gênica Mediada por CRISPR/Cas9 em Células Dividindo-se. J. Vis. Exp., (2017)

Este vídeo demonstra um método de ultracentrifugação em duas etapas, utilizando gradientes e colchões de sacarose, para purificar e concentrar partículas virais a partir do sobrenadante de cultura celular. O procedimento permite a separação com base na densidade de flutuação, possibilitando a recuperação de vírus intactos adequados para aplicações posteriores.

Protocolo

1. Concentração de Partículas Virais por Ultracentrifugação

NOTA: Utilizamos um método de purificação com duplo sacarose que envolve duas etapas: uma etapa de gradiente de sacarose e uma etapa de coxim de sacarose (Figura 1).

1. Carregue os tubos cónicos de ultracentrifugação na seguinte ordem para criar um gradiente de sacarose: 0,5 mL de sacarose a 70% (dissolvida em solução salina tamponada com fosfato 1x [PBS]), 0,5 mL de sacarose a 60% (dissolvida em DMEM), 1 mL de sacarose a 30% (dissolvida em meio Eagle Modificado de Dulbecco [DMEM]) e 2 mL de sacarose a 20% (dissolvida em PBS 1x).
2. Adicione cuidadosamente o sobrenadante contendo o vírus ao gradiente. Como o volume total do sobrenadante de quatro placas de 15 cm é de 100 mL, utilize seis tubos de ultracentrifugação por rotação para processar todo o volume do sobrenadante viral.
   1. Cada tubo de ultracentrifugação usado nesta etapa tem uma capacidade volumétrica de até 30 mL (incluindo o volume de sacarose). Distribua o sobrenadante viral igualmente entre os tubos, deixando pelo menos 10% de espaço livre para evitar derramamento.
   2. Ajuste o volume de cultura para ~20–22 mL por placa ao utilizar mais de quatro placas de 15 cm em cada experimento, de modo que o volume final do sobrenadante viral coletado possa ser facilmente acomodado em seis tubos de ultracentrifugação.
   3. Preencha os tubos de ultracentrifugação até pelo menos três quartos da sua capacidade total; caso contrário, pode ocorrer ruptura dos tubos durante a centrifugação, resultando em possível perda da amostra e/ou danos ao equipamento.
3. Equilibre os tubos com PBS 1x e centrifugue as amostras a 70.000 x g durante 2 h a 17 °C
   NOTA: Para evitar a perturbação da camada de sacarose durante a aceleração, configure a ultracentrífuga para acelerar lentamente o rotor até 200 rpm durante os primeiros 3 min da rotação. Da mesma forma, configure a ultracentrífuga para desacelerar lentamente o rotor de 200 rpm a 0 rpm ao longo de 3 min no final da rotação.
4. Colete cuidadosamente as frações de sacarose de 30–60% em tubos limpos (Figura 1). Adicione PBS 1x frio às frações reunidas e complete o volume até 100 mL; misture pipetando para cima e para baixo várias vezes.
5. Prossiga para a etapa do colchão de sacarose, colocando cuidadosamente a preparação viral sobre um colchão de sacarose. Para isso, adicione 4 mL de sacarose a 20% (em PBS 1x) ao tubo, seguido de ~20–25 mL da solução viral por tubo. Se os tubos estiverem menos do que três quartos cheios, complete com PBS 1x estéril.
6. Equilibre cuidadosamente e centrifugue as amostras a 70.000 x g durante 2 h a 17 °C, como antes. Despeje o sobrenadante e deixe o líquido restante escorrer invertendo os tubos sobre papel toalha.
7. Aspire as gotículas remanescentes para remover todo o líquido do pellet. Nesta etapa, os pellets contendo vírus devem ser mal visíveis como pequenas manchas translúcidas.
8. Resuspenda os pellets adicionando 70 µL de PBS 1x ao primeiro tubo e pipetando completamente a suspensão, transferindo subsequentemente a suspensão para o próximo tubo e misturando como antes, continuando até que todos os pellets estejam ressuspendidos.
9. Lave os tubos com mais 50 µL de PBS 1x frio e misture como antes. Certifique-se de que o volume combinado da suspensão final seja de ~120 µL e apresente uma aparência levemente turva; clarifique por centrifugação a 10.000 x g durante 30 s em uma microcentrífuga de bancada.
10. Transfira o sobrenadante para um tubo microcêntrifugo novo, prepare alíquotas de 10 µL e armazene-as a -80 °C.
    NOTA: Evite realizar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento nas amostras de lentivírus. Exceto quando a centrifugação for necessária, deve-se procurar realizar os passos restantes em capelas de cultura de tecidos ou em salas designadas para cultura de tecidos, utilizando medidas apropriadas de biossegurança.

Resultados

Figura 1: Concentração das partículas virais utilizando o protocolo de gradiente duplo de sacarose. Partículas virais coletadas do sobrenadante (SN) são aplicadas sobre um gradiente de sacarose. Soluções de sacarose a 70%, 60%, 30% e 20% são utilizadas para criar o gradiente. Após a centrifugação, as partículas coletadas das frações de sacarose entre 30-60% são novamente aplicadas sobre um colchão de sacarose a 20% e precipitadas. O pellet final contendo partículas virais purificadas é ressuspenso em PBS 1x para uso posterior.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento
Ultracentrífuga Optima XPN-80	Beckman Coulter	A99839
Centrífuga de bancada Allegra 25R	Beckman Coulter	369434
Tubos cónicos para ultracentrifugação com fundo cónico	Seton Scientific	5067
Adaptadores para tubos cónicos	Seton Scientific	PN 4230
Rotor oscilante SW32Ti	Beckman Coulter	369650
Tubos cónicos de centrífuga de 50 mL	Corning	430291
Pipetas para cultura de tecidos, 25 mL	Corning	4489