Avaliação do Título Lentiviral Utilizando um Ensaio Imunoenzimático (ELISA)

Resumo

Fonte: Vijayraghavan, S., et al. Protocolo para a Produção de Vetores Lentivirais Deficientes em Integrase para Inativação Gênica Mediada por CRISPR/Cas9 em Células em Divisão. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra o uso de um ELISA para p24 para estimar os títulos virais de vetores lentivirais. O ensaio envolve a lise de partículas virais para liberar p24, seu aprisionamento com anticorpos específicos e sua detecção por meio de um sistema ligado à peroxidase que produz uma mudança de cor mensurável. Ao comparar os valores de absorbância das amostras com uma curva padrão, o título viral é quantificado.

Protocolo

1. Estimativa de Títulos Virais

1. método de ensaio imunoenzimático (ELISA) para p24 (proteína da cápside p24 do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)-1) OBSERVAÇÃO: O ensaio é realizado utilizando placas de 96 poços de alta ligação conforme as instruções do Programa de Vacinas contra a AIDS do NIH para o Kit de Ensaio de Captura de Antígeno p24 do HIV-1 (ver Tabela de Materiais), com modificações.
   1. No dia seguinte, lave os poços três vezes com 200 µL de Tween 20 a 0,05% em PBS frio (solução PBS-T). Revesta a placa com 100 µL de anticorpo monoclonal anti-p24 na diluição de 1:1500 em PBS 1x e incube durante a noite a 4 °C.
   2. Para eliminar ligações inespecíficas, bloqueie a placa com 200 µL de BSA a 1% em PBS; lave três vezes com 200 µL de Tween 20 a 0,05% em PBS frio (solução PBS-T) por pelo menos 1 h à temperatura ambiente.
   3. Preparação das amostras: Para preparações concentradas de vetor, dilua 1 µL da amostra 100 vezes adicionando 89 µL de dd-H2O e 10 µL de Triton X-100 (concentração final de 10%). Para preparações não concentradas, prepare amostras diluídas dez vezes (adicione 80 µL de dd-H2O e 10 µL de Triton X-100 (concentração final de 10%) a 10 µL da amostra). OBSERVAÇÃO: As amostras podem ser armazenadas a -20 °C nesta etapa por um longo período para uso posterior.
   4. Prepare os padrões de HIV-1 aplicando uma diluição seriada de 2 vezes (com concentração inicial de 5 ng/mL).
   5. Dilua as amostras concentradas (a partir de estoques pré-diluídos 1:100) em RPMI 1640 (meio Roswell Park Memorial Institute 1640) suplementado com Tween 20 a 0,2% e BSA a 1% para obter diluições de 1:10.000, 1:50.000 e 1:250.000. Dilua as amostras não concentradas (a partir de estoques pré-diluídos 1:10) em RPMI 1640 suplementado com Tween 20 a 0,2% e BSA a 1% para obter diluições de 1:500, 1:2500 e 1:12.500.
   6. Adicione as amostras na placa em triplicata e incube durante a noite a 4 °C.
   7. No dia seguinte, lave os poços seis vezes e incube a 37 °C por 4 h com 100 µL de anticorpo policlonal de coelho anti-p24, diluído 1:1000 em RPMI 1640, 10% de soro fetal bovino (FBS), BSA a 0,25% e soro normal de camundongo (NMS) a 2%.
   8. Lave seis vezes como acima e incube a 37 °C por 1 h com anticorpo secundário de cabra anti-coelho IgG conjugado à peroxidase, diluído 1:10.000 em RPMI 1640 suplementado com 5% de soro normal de cabra, 2% de NMS, BSA a 0,25% e Tween 20 a 0,01%.
   9. Lave a placa, como acima, e incube com o substrato de peroxidase TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina) à temperatura ambiente por 15 min.
   10. Interrompa a reação adicionando 100 µL de HCl 1 N. Meça a absorbância das amostras a 450 nm utilizando um leitor de placas de absorbância.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes do ELISA p24
Anticorpo monoclonal anti-p24	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3537
Padrões de HIV-1	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Anticorpo policlonal de coelho anti-p24	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP451T
IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase do rabanete	Sigma Aldrich	12-348	Concentração de trabalho 1:1500
Soro de camundongo normal, estéril, 500 mL	Equitech-Bio	SM30-0500
Soro de cabra, estéril, 10 mL	Sigma	G9023	Concentração de trabalho 1:1000
Substrato de peroxidase TMB	KPL	5120-0076	Concentração de trabalho 1:10.000