Geração de Vírus Adeno-Associado Recombinante por Transfecção de Plasmídeos

Resumo

Fonte: Ding, J., et al. Preparação de rAAV9 para Superexpressão ou Silenciamento de Genes em Corações de Camundongos. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a produção de partículas de vírus adeno-associado recombinante por meio da transfeção de plasmídeos em células de mamíferos. Destaca a expressão coordenada das proteínas Rep, Cap e proteínas auxiliares que promovem a replicação do genoma viral e a montagem do capsídeo no núcleo.

Protocolo

1. Transfecção de Células HEK293 com Plasmídeos de Vírus Associado a Adenovírus Recombinante 9 (rAAV9)

1. Prepare uma solução de polietilenimina linear (PEI) a 1 µg/µl. Dissolva o pó de PEI em dH₂O livre de endotoxinas aquecido a 70-80 °C. Após resfriar até a temperatura ambiente (TA), neutralize a solução até pH 7,0 com HCl 1 M. Esterilize por filtração (0,22 µm) a solução. Aliquote a solução estoque de PEI a 1 µg/µl (1.400 µl/tubo) e armazene a solução a -20 °C.
2. Cultive células HEK293 em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de Soro Bovino Fetal (SBF) e 1% de penicilina/estreptomicina. Cultive as células em uma incubadora a 37 °C com 5 ± 0,5% de dióxido de carbono (CO₂).
3. No dia 0, plaque células HEK293 em dez placas de 150 mm, 18-20 horas antes da transfeção, dividindo células com confluência > 90% em uma diluição 1:2.
   NOTA: No dia 1, as células devem atingir 90% de confluência.
4. No dia 1, transfecte células HEK293 com o plasmídeo rAAV9 (por exemplo, construtos rAAV9.cTNT::GFP ou rAAV6.U6::shRNA), plasmídeo Ad-Helper e plasmídeo AAV-Rep/Cap utilizando PEI.
   1. Para 10 placas de células com 90% de confluência, misture 70 µg do plasmídeo AAV-Rep/Cap, 70 µg do plasmídeo rAAV9 e 200 µg do plasmídeo Ad-Helper em um tubo cônico de 50 ml.
   2. Se as células forem menos confluentes, ajuste a quantidade de DNA proporcionalmente. Por exemplo, se as células estiverem com 75% de confluência, reduza a quantidade de DNA proporcionalmente (75/90 da quantidade indicada na etapa 1.4.1): misture 70 x 75/90 = 58,3 µg do plasmídeo AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58,3 µg do plasmídeo rAAV9 e 200 x 75/90 = 166,7 µg do plasmídeo Ad-Helper em um tubo cônico de 50 ml.
   3. Adicione 49 ml de DMEM à temperatura ambiente (sem SBF) ao tubo de 50 ml e homogeneíze bem.
   4. Adicione 1.360 µl da solução de PEI para obter uma razão PEI:DNA (v/p) de 4:1. Misture bem. Incube à temperatura ambiente por 15-30 min.
   5. Adicione 5 ml da mistura preparada na etapa 1.4.4 a cada placa de 150 mm (50 ml da mistura para dez placas de 150 mm).
5. Cultive as células em uma incubadora a 37 °C com 5 ±0,5% de CO₂ por 60-72 h.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Polietilenimina, Linear (PM 25.000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Tubo, Polipropileno, 36,2 ml, 25 x 87 mm, (quant. 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Meio DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Soro bovino fetal	Atlanta Biologicals	S11150
Vetor rAAV9	Penn Vector Core	P1967