Purificação de Partículas Virais Recombinantes de Células Renais Humanas Transfectadas

Resumo

Fonte: Ding, J. et. al., Preparação de rAAV9 para Superexpressar ou Silenciar Genes em Corações de Camundongos. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo mostra a purificação de partículas virais recombinantes a partir de células renais humanas transfectadas. O vírus é liberado por lise por congelamento-descongelamento e purificado utilizando gradientes de iodixanol com filtração assistida por copolímero em bloco.

Protocolo

1. Transfecção de Células HEK293 com Plasmídeos de Vírus Adeno-Associado Recombinante 9 (rAAV9)
   1. Prepare uma solução de polietilenimina (PEI) linear a 1 µg/µl. Dissolva o pó de PEI em H₂O livre de endotoxinas aquecida a 70-80 °C. Após resfriar à temperatura ambiente (RT), neutralize a solução a pH 7,0 com ácido clorídrico (HCl) 1 M. Esterilize por filtração (0,22 µm) a solução. Aliquote a solução estoque de PEI a 1 µg/µl (1.400 µl/tubo) e armazene a -20 °C.
   2. Cultive células HEK293 em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina. Incube as células a 37 °C em atmosfera com 5 ± 0,5% de dióxido de carbono (CO₂).
   3. No dia 0, semeie células HEK293 em dez placas de 150 mm, 18-20 horas antes da transfeção, dividindo células com confluência > 90% em diluição 1:2.
      NOTA: No dia 1, as células devem atingir 90% de confluência.
   4. No dia 1, transfecte as células HEK293 com o plasmídeo rAAV9 (por exemplo, construtos rAAV9.cTNT::GFP ou rAAV6.U6::shRNA), plasmídeo Ad-Helper e plasmídeo AAV-Rep/Cap utilizando PEI.
      1. Para 10 placas de células com 90% de confluência, misture 70 µg do plasmídeo AAV-Rep/Cap, 70 µg do plasmídeo pfrAAV9 e 200 µg do plasmídeo Ad-helper em um tubo cônico de 50 ml.
      2. Se as células apresentarem menor confluência, ajuste a quantidade de DNA proporcionalmente. Por exemplo, se as células estiverem com 75% de confluência, reduza a quantidade de DNA proporcionalmente (75/90 da quantidade indicada no passo 2.4.1): misture 70 x 75/90 = 58,3 µg do plasmídeo AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58,3 µg do plasmídeo rAAV9 e 200 x 75/90 = 166,7 µg do plasmídeo Ad-Helper em um tubo cônico de 50 ml.
      3. Adicione 49 ml de DMEM na temperatura ambiente (sem FBS) ao tubo de 50 ml e homogeneíze bem.
      4. Adicione 1.360 µl da solução de PEI para obter uma razão PEI:DNA (v/w) de 4:1. Misture bem. Incube à temperatura ambiente por 15-30 min.
      5. Adicione 5 ml da mistura preparada no passo 1.4.4 a cada placa de 150 mm (50 ml da mistura para dez placas de 150 mm).
   5. Cultive as células em incubadora a 37 °C com 5 ± 0,5% de CO₂ por 60-72 horas.
2. Coleta das Células HEK293 Transfectadas e Purificação de Vetores rAAV9
   1. Colete as células 60-72 horas após a transfeção. Solte e suspenda as células nas placas por pipetagem repetida com o meio de cultura. Transfira todas as suspensões celulares para tubos cónicos estéreis de 50 ml.
   2. Centrifugue as células a 500 x g por 5 min. Re-suspenda o pellet celular com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em cada tubo e combine todas as suspensões celulares em um único tubo de 50 ml.
   3. Centrifugue as células a 500 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante. Neste ponto, armazene o pellet celular a -80 °C ou purifique imediatamente o AAV a partir do pellet, conforme descrito nos passos 2.4-2.15.
   4. Prepare o tampão de lise: 150 mM de cloreto de sódio (NaCl) e 20 mM de cloreto de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl, pH 8,0). Esterilize por filtração (0,22 µm). Armazene o tampão a 4 °C.
   5. Re-suspenda o pellet com 10 ml de tampão de lise.
   6. Congele o lisado a -80 °C ou em banho de gelo seco/etanol e, em seguida, descongele a 37 °C. Vortex por 1 min. Repita o ciclo de congelamento-descongelamento três vezes.
   7. Adicione solução de cloreto de magnésio (MgCl₂) ao lisado descongelado (ajustando a concentração final de MgCl₂ no lisado para 1 mM). Adicione nucleases para obter uma concentração final de 250 U/ml. Incube a 37 °C por 15 min para solubilizar agregados de DNA/proteína.
      NOTA: Se os agregados de DNA/proteína não forem dissolvidos após o tratamento com nucleases ou endonucleases, homogeneíze os lisados com pistilo de Dounce por 20 vezes.
   8. Centrifugue a amostra a 4.800 x g por 20 min a 4 °C. Recolha o sobrenadante.
   9. Enquanto isso, prepare a solução para gradiente de iodixanol:
      1. Prepare a solução a 17% misturando 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de MgCl₂ 1 M, 0,125 ml de cloreto de potássio (KCl) 1 M, 10 ml de NaCl 5 M e 12,5 ml de meio de gradiente de densidade. Ajuste o volume total para 50 ml com H₂O.
      2. Prepare a solução a 25% misturando 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de MgCl₂ 1 M, 0,125 ml de KCl 1 M, 20 ml de meio de gradiente de densidade e 0,2 ml de vermelho de fenol 0,5% (p/v). Ajuste o volume total para 50 ml com H₂O.
      3. Prepare a solução a 40% misturando 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de MgCl₂ 1 M, 0,125 ml de KCl 1 M e 33,3 ml de meio de gradiente de densidade. Ajuste o volume total para 50 ml com H₂O.
      4. Prepare a solução a 60% misturando 0,05 ml de MgCl₂ 1 M, 0,125 ml de KCl 1 M, 50 ml de meio de gradiente de densidade e 0,1 ml de vermelho de fenol 0,5% (p/v).
   10. Com agulha e seringa, carregue a solução de gradiente de iodixanol no tubo de polipropileno na ordem de 5 ml de 17%, 5 ml de 25%, 5 ml de 40% e 5 ml de 60%, começando pelo fundo. Adicione todo o lisado obtido no passo 3.8 (14-16 ml) sobre o gradiente. O gradiente, listado de baixo para cima, é 60%, 40%, 25%, 17% e a camada de lisado. Complete o tubo com tampão de lise e cubra com rolha.
   11. Centrifugue a 185.000 x g por 90 min a 16 °C.
   12. Recupere a fração viral (camada de 40%) com uma seringa. Insira a agulha (21 gauge) na interseção entre as frações de 40% e 60%, aspirando apenas a camada de 40%.
       NOTA: Evite aspirar a camada de 25%.
   13. Misture a fração viral com solução esterilizada de copolímero em bloco de polioxietileno-polioxipropileno em PBS (estoque de copolímero em bloco de polioxietileno-polioxipropileno a 10% diluído 1:10.000 em PBS) até um volume total de 15 ml. Carregue a mistura no tubo de filtração (corte de peso molecular = 100 kD). Centrifugue a 2.000 x g por 30 min a 4 °C.
   14. Descarte a solução do fundo. Reabasteça o tubo de filtração com solução de copolímero em bloco de polioxietileno-polioxipropileno em PBS até um volume total de 15 ml. Centrifugue a 2.000 x g por 20 min a 4 °C. Repita este passo mais duas vezes. Recolha o vírus rAAV9 purificado (fração acima do filtro).
   15. Transfira o rAAV9 purificado do tubo de filtração para tubos de 1,7 mL. Aliquote o rAAV9 purificado (100-400 µl/tubo, dependendo do volume e título do AAV) e armazene o vírus a -80 °C.
       NOTA: Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Polietilenimina, linear (MW 25.000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Tubo, polipropileno, 36,2 ml, 25 x 87 mm, (quant. 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Nuclease, ultrapuro	SIGMA	#E8263-25KU
Meio de gradiente de densidade (Iodixanol)	SIGMA	#D1556-250ML
Unidade de filtro centrífugo com membrana Ultracel-100	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
Agulha de pipetagem de laboratório com pontas rombas de 90°, calibre 14, L 6 pol., haste niquelada	SIGMA	#CAD7942-12EA
Solução de Poloxâmero 188 (solução Pluronic® F-68)	SIGMA	P5556-100ML
Proteinase K	SIGMA	3115828001
DNase I	Roche	10104159001
Máquina de centrífuga	Thermo Scientific	75004260
Sistema de centrífuga	Beckman Coulter	363118
Ultracentrífuga	Beckman Coulter
Meio DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Soro bovino fetal	Atlanta Biologicals	S11150
Vetor rAAV9	Penn Vector Core	P1967