Imortalização de Células Endoteliais via Transdução Retroviral de Oncogenes Virais

Resumo

Fonte: McAllister, S. C., Hanson, R. S., et al. Um Modelo In Vitro para o Estudo da Transformação Celular pelo Herpesvírus do Sarcoma de Kaposi J. Vis. Exp.(2017)

Este vídeo demonstra a transdução retroviral de células endoteliais primárias com os oncogenes HPV16 E6/E7. Os oncogenes integrados inativam os supressores tumorais p53 e Rb, prolongando a longevidade celular. A seleção com G418 enriquece as células transduzidas, gerando culturas endoteliais imortalizadas adequadas para estudos de transformação.

Protocolo

Transdução de células endoteliais (CE) com os genes do Papilomavírus E6 e E7

NOTA: Rotineiramente utilizamos frascos padrão de cultura de tecidos para o crescimento de EC primárias. No entanto, se o crescimento das EC obtido for insatisfatório, deve-se considerar o uso de frascos de cultura comerciais.

1. Cultivar células endoteliais primárias humanas microvasculares dérmicas ou linfáticas em um incubador umidificado a 37 °C mais 5% CO₂₂ em meio de crescimento para células endoteliais (EGM; contém meio basal para células endoteliais [EBM] suplementado com EGM-2 BulletKit [contendo soro bovino fetal, hidrocortisona, fator de crescimento de fibroblastos humanos-B, fator de crescimento de células endoteliais vasculares, fator de crescimento semelhante à insulina-1, ácido ascórbico, fator de crescimento epidérmico humano, antibióticos e heparina]) em um frasco de cultura celular T75 até aproximadamente 50% de confluência.
2. Para transdução, cultive as células PA317 LXSN 16E6E7 em um incubador umidificado a 37 °C com 5% de CO₂ em meio de cultura Dulbecco modificado (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal e agentes antimicrobianos em um frasco de cultura celular T150 até atingirem cerca de 90% de confluência. Em seguida, incube durante a noite em 16 mL de meio. 37 °C mais 5% CO₂₂ em meio Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal e antimicrobianos em um frasco de cultura celular T150 até atingirem aproximadamente 90% de confluência. Em seguida, incubar durante a noite em 16 mL de meio.
3. Clarifique o meio PA317 por centrifugação a 300 × g durante 5 min em temperatura ambiente. × g por 5 min à temperatura ambiente.
4. Remova o EGM do cultivo de EC e sobreponha as células com 12 mL do meio PA317 clarificado e incube por 4 h.
   NOTA: Centrifugar 16 mL de meio condicionado a 300 × g durante 5 min em temperatura ambiente. × g por 5 min resulta em um pellet compacto que não é perturbado pela remoção cuidadosa subsequente de 12 mL do sobrenadante clarificado. No entanto, se houver preocupação com a transferência de células PA317 LXSN 16E6E7 para culturas primárias de EC (a linhagem de células empacotadoras irá rapidamente supercrescer as EC), então a filtração do sobrenadante condicionado através de um 0.45 µm filtrar antes da transferência pode ser realizado.
5. Substitua 6 mL do meio PA317 por EGM fresco e incube durante a noite.
6. Reponha o meio nas EC com 12 mL de EGM fresco e incube por mais 48 h.
7. Para subcultivar as EC, remova o meio e lave com 12 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cátions, adicione 3 mL de solução enzimática de dissociação comercial (por exemplo, TrypLE) e incube a 37 °C por 3 min.
8. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 300 × g por 5 min à temperatura ambiente. Ressuspender o pellet celular resultante em EGM fresco e dividir igualmente em 3 × frascos T75 com um volume final de 12 mL de EGM por frasco.
9. Para selecionar as EC transduzidas com E6 e E7, adicione G418 até uma concentração final de 200 µg/mL por duas passagens, após as quais as EC transduzidas podem ser semeadas para infecção ou congeladas em nitrogênio líquido.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células BCBL-1	NIH AIDS Reagent Program	3233
Células PA317	ATCC	CRL-2203
Células endoteliais microvasculares dérmicas neonatais	Lonza	CC-2505
Meio basal EBM-2	Lonza	CC-3156
Kit EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
RPMI
DMEM
PBS com cálcio e magnésio