Visualização e Avaliação do Tamanho de Faustovirus Utilizando Microscopia Eletrônica

Resumo

Fonte: Bou Khalil, J. Y., et al. Uma Estratégia Rápida para o Isolamento de Novos Faustovírus a Partir de Amostras Ambientais Utilizando Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra a obtenção de imagens de partículas de faustovírus a partir de um cultivo de ameba infectada utilizando microscopia eletrônica de transmissão. Ele abrange a preparação da grade, coloração negativa com molibdato de amônio para aumentar o contraste e a visualização do vírus ao microscópio. O protocolo conclui com a medição do tamanho do faustovírus utilizando as ferramentas de software integradas ao microscópio.

Protocolo

1. Microscopia Eletrônica
   1. Após a primeira identificação nas lâminas, avalie a presença do vírus gigante por meio da observação por microscopia eletrônica de culturas em sobrenadante.
   2. Deposite 5 µl da amostra positiva sobre a grade previamente submetida à descarga elétrica. Aguarde aproximadamente 20 minutos em temperatura ambiente.
   3. Seque cuidadosamente a grade e deposite sobre ela uma pequena gota de molibdato de amônio a 1% durante 10 segundos. Deixe a grade secar por 5 minutos.
   4. Prossiga com a microscopia eletrônica a 200 keV.
   5. Coloque a grade no suporte; insira o suporte no microscópio. Verifique a visão geral do vácuo clicando no ícone correspondente. Feche as válvulas e inicie a observação com tamanho de ponto 5 e magnificação de x 25.000.
   6. Meça o vírus gigante utilizando o ImageJ ou diretamente no microscópio, usando a ferramenta de medição localizada na tela de aquisição.
      NOTA: Classifique a amostra no grupo Faustovirus com um tamanho de capsídeo de aproximadamente 200 nm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Estirpe de ameba CDC-19	ATCC	França	50237
Placas	Cellstar	França	655180
Filtros com vácuo	Thermo scientific	França	BPV4550 / 20170115
Solução salina tamponada com fosfato	Thermo Fisher scientific	França	10010-023
Corante DAPI	Life Technologies	França	D1306
Grade de carbono	Euromedex	França	FCF400NI
Molibdato de amônio	VWR internationanl	França	21276185
Frascos	SARSTEDT	Alemanha	833911
Filtros de 0,22 μm	Milex millipor	França	SE2M229104
Ultracentrífuga Sorval WX 80	Thermo scientific	França	9102448
Filtros de fluxo rápido	Nalgene	França	450-0020