Determinação da Distribuição de RNA Viral em Células Hospedeiras por Hibridização In Situ Fluorescente

Resumo

Fonte: Vallery, T. K. & Steitz, J. A. Hibridização Fluorescente In Situ Quantitativa (FISH) e Imunofluorescência (IF) de Produtos Gênicos Específicos em Células Infectadas pelo KSHV. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a hibridização fluorescente in situ para visualizar RNA viral em células infectadas por vírus. Ele descreve as etapas envolvidas na hibridização da sonda, amplificação do sinal e imagem confocal.

Protocolo

1. Fixação, Hibridização e Visualização de RNAs Virais

1. Remova o meio e as células em excesso. Ao longo deste protocolo, utilize sucção a vácuo para remover as soluções e pipetagem suave com micropipeta para adicionar as soluções.
   OBSERVAÇÃO: A intensidade de um vácuo pode ser reduzida ao colocar um 200 µL ponta de micropipeta sobre a pipeta de vidro de Pasteur. Substitua a ponta da micropipeta entre cada etapa de lavagem para prevenir contaminação. Cada etapa de lavagem deve ser realizada rapidamente, pois é imperativo que as células nunca sequem.
2. Imediatamente, fixe as células com formaldeído a 4% em PBS (solução salina tamponada com fosfato) previamente resfriado no gelo durante 30 min. Lave as células três vezes com 200 µL 1x PBS resfriado a 4 °C e incubar por 5 min a temperatura ambiente ou sobre gelo.
   1. Permeabilize as células fixadas com 200 µL de 0,5% de Triton-X/PBS pré-resfriado por 10 min no gelo ou 750 µL de etanol 70% pré-resfriado em 4 °C por 1 h (mín.) a 7 d (máx.).
      OBSERVAÇÃO: Todas as lavagens ao longo deste protocolo são realizadas da mesma maneira, salvo indicação em contrário. O etanol a 70% afrouxa a cola entre as câmaras e a lâmina, o que facilita a separação posterior, e também proporciona uma pausa significativa no protocolo. Mesmo assim, utilize filme de parafina ao redor da lâmina com câmara para reduzir a evaporação e verifique o nível do etanol em cada câmara aproximadamente a cada 8 h. O etanol a 70% também aplaina as células, proporcionando uma imagem mais nítida, enquanto o Triton-X não desidrata as células nem altera suas dimensões.
3. Remova as câmaras cuidadosamente para evitar rachaduras no lâmina.
   OBSERVAÇÃO: Utilize um dispositivo de remoção novo ou um com muito pouco adesivo residual fornecido pelo fabricante, e retire cuidadosamente as câmaras para evitar que a lâmina trinque. O uso de etanol a 70% como reagente de permeabilização por 4 h reduz significativamente a probabilidade de trincas. Em caso de trinca, prossiga com o protocolo nas câmaras não afetadas pela trinca e tenha em mente a taxa mais elevada de oxidação de lâminas imperfeitamente seladas (ou seja, vida útil reduzida durante o armazenamento).
4. Lave as células uma vez com SSC 2x (citrato de sódio e cloreto de sódio) e, em seguida, aplique 45 µL da solução de hibridização composta por 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrana, 2x SSC, 0,1% de albumina sérica bovina (BSA), 500 µg/mL ácido desoxirribonucleico (DNA) de esperma de salmão, 125 µg/mL E. coli ácido ribonucleico de transferência (tRNA) e complexos de ribonucleosídeo de vanadilo 1 mM. Incubar por 1 h a 37 °C em uma câmara úmida que pode ser uma placa de Petri de 150 mm com toalhas estéreis umedecidas.
   OBSERVAÇÃO: Prepare a solução de hibridização fresca pelo menos uma hora antes do uso. Dissolva primeiro o sulfato de dextrana em água, fazendo vortex frequentemente e incubando em um 37 °C banho-maria
5. Calcule a quantidade de oligonucleotídeos necessária para atingir a concentração sugerida de 25 µM em 35 µL de solução de hibridização por câmara. Ajuste a concentração do oligonucleotídeo anti-sense conforme necessário. Adicione água destilada aos oligonucleotídeos para completar o volume de desnaturação até 10 µL.
   OBSERVAÇÃO: Após a reação de marcação, os oligonucleotídeos são armazenados na solução tamponada contendo 0,18 M cacodilato de potássio, 23 mM Tris-HCl, 0,23 mg/mL de BSA, 4,5 mM CoCl₂₂, 18 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), 2,7 mM de fosfato de potássio e 6,8 mM de KCl, 45 µM 2-mercaptoetanol, 0,02% Triton X-100 e 2% glicerol. As concentrações são suficientemente altas para que a diluição com água leve a solução de desnaturação a concentrações próximas de 1x TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA), um tampão padrão para desnaturação de oligonucleotídeos.
6. Desnaturar os oligonucleotídeos marcados com digoxigenina (DIG) e/ou Alexa Fluor 594 a 95 °C por 5 min. Em seguida, adicione 35 µL solução de hibridização fresca por câmara prevista aos oligonucleotídeos desnaturados. Se for realizada hibridização fluorescente in situ dupla (FISH), ambos os conjuntos de oligonucleotídeos antissenso podem ser desnaturados e hibridados juntos.
7. Remova a solução de pré-hibridização e, em seguida, adicione a solução de hibridização contendo os oligonucleotídeos marcados às células. Incube durante a noite na câmara úmida a 37 °C com papel alumínio para proteger os oligonucleotídeos marcados com fluoróforo.
   OBSERVAÇÃO: A incubação deve ser de pelo menos 10 h e não mais que 24 h.
8. No dia seguinte, lave as células duas vezes com SSC 2x durante 10 min a 37 °C e depois duas vezes com SSC 1x por 10 min em 25 °C.
9. Fixe as células com formaldeído a 4% em PBS 1x pré-resfriado por 10-15 min no gelo. Em seguida, lave as células com PBS três vezes e permeabilize por 1 h com etanol a 70% pré-resfriado ou por 10 min com Triton-X 0,5% em PBS 1x pré-resfriado em gelo 4 °C.
10. Incubar as células com anti-digoxigenina (DIG)–isotiocianato de fluoresceína (FITC) na proporção de 1:200 em PBS 1x com BSA 0,1% pré-resfriado durante 1 h a 4 °C. Remova a solução de anticorpo e lave três vezes com PBS 1x.
11. Fixar com formaldeído a 4% pré-resfriado em PBS 1x por 10-15 min em 4 °C e depois lavar três vezes com PBS 1x.
12. Incubar as células com 0.4 µg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBS 1x com Triton-X a 0,5% pré-resfriado por 15 min no gelo e, em seguida, lavar três vezes com PBS 1x.
13. Monte as lâminas com microesferas fluorescentes (opcional) e um meio de montagem. Em seguida, selar o lamínula à lâmina com esmalte incolor.
14. Utilizando um microscópio confocal, colete imagens das amostras entre uma hora e uma semana após a realização do protocolo, com aumento de 630x. Aplique várias camadas de esmalte para unhas para selar a lamínula e prolongar a vida dos fluoróforos, reduzindo a taxa de oxidação.
    OBSERVAÇÃO: Não utilize um meio de montagem contendo DAPI. Ao coletar as imagens, inclua a barra de escala em cada imagem para quantificação posterior. As microesferas fluorescentes servem como controles da intensidade de fluorescência entre lâminas e preparações de amostras. Adquira imagens na seção mediana da célula para quantificação bidimensional (2D).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
Sulfato de dextrana	Sigma Aldrich	D8906	Grau biologia molecular
Kit de caudalização com oligonucleotídeos DIG	Sigma Roche	#03353583910	2ª geração
Lâminas com oito câmaras	Nunc Lab Tek II	#154453	O selo azul promove tensão superficial, mas também está disponível separação por gel transparente.
Formamida	Sigma Aldrich	F9037	Grau biologia molecular
Complexos de ribonucleosídeos de vanadilo	NEB	S1402S