Medição da Indução Espontânea de Fagos em Bactérias Lisogênicas ao Longo do Tempo

Resumo

Fonte: Krishnamurthi, R., et al. Compreendendo o Impacto dos Bacteriófagos Temperados sobre seus Lisogênicos por meio da Transcriptômica. J. Vis. Exp. (2024).

Este vídeo demonstra a enumeração temporal da indução espontânea de fagos em Pseudomonas aeruginosa lisogênica mediante a quantificação de células bacterianas viáveis (UFCs) e partículas de fago infecciosas (UPFs) ao longo do tempo. Ao coletar amostras em intervalos definidos durante o crescimento e analisar tanto a formação de colônias quanto de placas, o método revela quando a indução espontânea é mínima. Isso permite a identificação de pontos de tempo ideais para análises transcritômicas subsequentes com interferência lítica mínima.

Protocolo

1. Enumeração direta temporal da indução espontânea (Figura 1)

1. Prepare culturas iniciadoras noturnas de ambos o lisogênico (por exemplo, lisogênico de P. aeruginosa PAO1 que abriga fagos LES (Liverpool Epidemic Strain (LES) bacteriófagos)) e o hospedeiro indicador (PAO1-Rif^R) (resistente à rifampicina Pseudomonas aeruginosa PAO1) inoculando uma única colônia em 5 mL de LB (caldo Luria–Bertani) e incubando a 37 °C com agitação a 180 rpm (18–24 h).
2. Prepare culturas frescas de lisogênio e de hospedeiro indicador inoculando as culturas mantidas durante a noite em 100 mL de caldo LB na proporção de 1:100 e incube a 37 °C com agitação (180 rpm).
   1. Monitore o crescimento do lisogênico medindo a OD₆₀₀ e contagem viável utilizando a técnica de Miles Misra. Para isso, colete uma amostra de 1 mL de cada cultura de lisogênio a cada hora, a partir do momento da inoculação, durante 8 h.
   2. Dilua seriamente a amostra imediatamente após a coleta, adicionando 100 µL da amostra em 900 µL do meio respectivo. Vortexar bem na velocidade máxima, descartar a ponteira a cada diluição e continuar a série de diluições de 10⁻¹ a 10⁻⁹.
   3. Pipete 10 µL das diluições necessárias em triplicata em uma placa de ágar LB, deixar secar e incubar a 37 °C por 18–24 h.

   4. Para calcular o número de células bacterianas viáveis, identifique uma diluição com colônias facilmente contáveis. Conte o número de colônias em cada ponto e, em seguida, utilize a seguinte fórmula:
       

      

      
      NOTA: À medida que a cultura do lisogênio cresce, partículas fágicas ativas serão produzidas por indução espontânea. A produção de fagos infecciosos significa que o transcriptoma da população lisogênica está agora contaminado com a expressão gênica associada ao ciclo de replicação lítica, proveniente do sinal de replicação do fago lítico e da resposta correspondente da célula hospedeira. É, portanto, importante identificar a fase de crescimento na qual a proporção entre células lisogênicas e partículas fágicas infecciosas livres é mais alta, a fim de limitar ao máximo o ruído transcricional de fundo (gerado pelo transcriptoma do fago lítico) no conjunto de dados.

3. Para enumerar as partículas de fago infecciosas em cada amostra temporal, inocular 5 mL de ágar bacteriológico estéril a 0,4% em LB (ágar superior) com 100 µL de hospedeiro indicador na fase exponencial média (OD600: 0,4–0,5; neste caso, PAO1-Rif^Rna presença de um agente seletivo apropriado (50 µg·mL⁻¹ rifampicina neste caso, já que a MIC da cepa PAO1 é apenas 16 µg·mL⁻¹)
   1. Pipetar 10 µL da mesma diluição seriada (ver etapa 1.2.2) sobre a camada de ágar superior inoculada, e deixe secar antes de incubar a 37 °C por 18–24 h.

   2. Para calcular o número de partículas de fago infecciosas, identifique uma diluição com placas facilmente contáveis. Conte o número de placas em cada ponto.
       

      

   3. Encontre o tempo/condição para o qual a indução espontânea por UFC (unidade formadora de colônia) é mínima para os próximos passos experimentais.

Resultados

Figura 1: O delineamento experimental para a enumeração de PFU e UFC de um lisogênico a partir da mesma amostra.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
PAO1		6
LESB58		6
Bacteriófagos LES	Induzidos e purificados de LESB58 utilizando Norfloxacina.
Caldo Lysogeny (LB)	Merck	1.10285.500
Ágar LB	Merck	1.10283.500
Ágar Ágar	Fisher	A/1080/53
Ágar superior	0,4 g de Ágar Ágar + 2,5 g de Caldo LB em 100 mL de água; autoclavar e usar.	-
Rifampicina	Sigma (Estoque: 50 mg/mL em Metanol – Misturar bem e esterilizar com filtro de 0,22 µm, armazenar a -20 °C até o uso)	R3501