Este vídeo demonstra a indução da replicação lítica em um profago integrado ao genoma bacteriano e a captura das alterações na expressão gênica por meio de amostragem temporal para análise transcriptômica.
Artigo de método
Indução da Replicação Lítica do Prófago para Análise Transcriptômica
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30 de setembro de 2026
Neste artigo
Resumo
Protocolo
1. Preparação de culturas de lisogênicos não induzidas e induzidas para extração de RNA (ácido ribonucleico)
- Prepare um cultivo fresco noturno inoculando uma única colônia do lisogênico em 5 mL de LB, e incube a 37 °C com agitação (180 rpm (rotações por minuto)) por 18–24 h.
- Subcultive o cultivo noturno em 80 mL de LB (caldo de lisogenia) na proporção de 1:100 em oito frascos de 250 mL.
- Rotule o primeiro frasco como “não induzido” e os demais como “induzidos”, juntamente com os pontos de tempo em que cada amostra deve ser colhida (por exemplo, “induzido t = 0”, “induzido t = 10 min”, “induzido t = 20 min”, etc.; (Figura 1).
- Após 90 min de incubação, quando a DO (Densidade Óptica) 600 estiver entre 0,1–0,2, ou no momento de indução espontânea mínima (ver discussão), adicione 4 µL de ácido acético glacial a 1% (v/v) ao frasco não induzido (Figura 1).
NOTA: Como o agente indutor neste trabalho foi preparado usando ácido acético glacial a 1% como solvente, a mesma quantidade de solvente foi adicionada isoladamente como etapa controle. Controles alternativos podem ser considerados dependendo da preparação de diferentes indutores. - Adicione o cultivo de 80 mL do frasco não induzido a 720 mL de LB estéril e imediatamente adicione a solução de parada (fenol gelado a 5% [v/v], pH 4,3, etanol a 95% [v/v]) usando um volume equivalente a 20% do volume do cultivo (160 mL) e incube em gelo por um mínimo de 30 min e não mais que 2 h para estabilizar os transcritos de RNA. Esta é a amostra não induzida.
- Induza os cultivos restantes em sete frascos de 250 mL (Figura 1) com a CMIM (Concentração Mínima Inibitória Final) de um agente indutor apropriado (neste caso, norfloxacina a 25 mg·mL−1, preparada em ácido acético glacial a 1% [p/v], usada em concentração final de 1 µg·mL−1), homogeneíze bem e incube a 37 °C com agitação a 180 rpm por 1 h.
NOTA: Esta etapa forçará o cultivo lisogênico a um estado mais coordenado de replicação lítica. A maioria das células no cultivo começará a produzir partículas de fago infecciosas de forma lítica. - Permita que as células se recuperem adicionando 80 mL de cultivo do frasco induzido a 720 mL de LB estéril, o que efetivamente dilui o agente indutor. Colete as células bacterianas de cada frasco a cada 10 min a partir do tempo 0 até 1 h, adicionando a solução de parada, conforme mencionado na etapa 1.5.
NOTA: A solução de parada estabiliza o RNA por até 2 h. No entanto, para aumentar a estabilidade da amostra, realize todas as etapas subsequentes a 4 °C. - Recolha por centrifugação a 10.000 x g por 15 min a 4 °C o mais rápido possível, sem exceder 2 h após o tratamento para evitar degradação do RNA.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente os pellets bacterianos no líquido residual usando uma pipeta automática ajustável antes de transferir cada amostra para um tubo microcêntrifugo de 1,5 mL.
- Centrifugue os tubos microcêntrifugos em alta velocidade (13.000 x g) em um microcentrífugo a 4 °C por 1 min e descarte o sobrenadante residual.
- Congele rapidamente os pellets mergulhando cada tubo microcêntrifugo fechado em nitrogênio líquido. Isso facilitará a lise eficiente das células para extração de RNA.
- Adicione TRIzol (1 mL) a cada pellet congelado e homogeneíze a suspensão por pipetagem (não vortex). Armazene a −80 °C até estar pronto para realizar a extração de RNA de todas as amostras.
NOTA: O protocolo pode ser interrompido neste ponto. - Repita as etapas 1.1–1.13 com três réplicas biológicas.
Resultados
Figura 1: O delineamento experimental para a coleta de culturas induzidas e não induzidas para isolamento de RNA.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fagos LES | Induzidos e purificados a partir de LESB58 usando Norfloxacino. | Este estudo | |
| Caldo de Lisogenia (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
| Ágar Caldo de Lysogenia (LB) | Merck | 1.10283.500 | |
| Ágar-Ágar | Fisher | A/1080/53 | |
| Ágar Superior | 0,4 g de Ágar-Ágar + 2,5 g de Caldo LB em 100 mL de água; autoclavar e usar. | - | |
| Rifampicina | Sigma (Estoque: 50 mg/mL em Metanol – Misturar bem e esterilizar com filtro de 0,22 µm, armazenar a -20 °C até o uso) | R3501 | |
| Ácido Acético Glacial | Fisher 1% (v/v) em água | 10060000 | |
| Norfloxacino | Sigma (Estoque: 25 mg/mL em Ácido Acético Glacial 1% – Misturar bem e esterilizar com filtro de 0,22 µm, armazenar a -20 °C até o uso; para evitar ciclos de congelamento e descongelamento, armazenar em pequenas alíquotas) | N9890 | |
| Fenol saturado com tampão citrato pH 4,3 | Sigma | P-4682 | |
| Etanol grau biologia molecular | Fisher | 16695992 | |
| TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
| Clorofórmio | Fisher | 11398187 | |
| Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
| Água livre de nucleases | Invitrogen | 10526945 |
