Colheita de Vírus Adenoassociado de Células Mamíferas Transfectadas

Resumo

Fonte: Rghei, A. D., et al. Produção de Vetores de Vírus Associado a Adenovírus em Pilhas de Células para Estudos Pré-clínicos em Modelos Animais de Grande Porte. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a recuperação do vírus adeno-associado bruto a partir de células de mamíferos transfectadas utilizando lise química e centrifugação, permitindo a produção de AAV com alto rendimento para purificação subsequente e aplicações em terapia gênica pré-clínicas.

Protocolo

1. Coleta do AAV (vírus adeno-associado) e lise química das células HEK293 (células renais embrionárias humanas 293) transfectadas

1. Agite vigorosamente a câmara de cultura celular para desprender as células até que o meio fique turvo devido às células desprendidas e despeje em quatro tubos de centrífuga de 500 mL.
2. Centrifugue os tubos a 18.000 x g durante 30 min a 4 °C para obter o pellet celular. Despeje o sobrenadante clarificado em uma garrafa de 1 L de copoliéster de tereftalato de polietileno (PETG).NOTA: Caso não se tenha acesso a uma centrífuga de alta velocidade, centrifugue a 12.000 x g durante 40 min. O pellet celular pode não ser sólido nessa velocidade e deslizará ao despejar o sobrenadante.
3. Resuspenda os pellets celulares em tubos de centrífuga de 500 mL com 50 mL de tampão de lise e incube por 60 min a 37 °C.
4. Centrifugue os tubos a 18.000 x g durante 30 min e, em seguida, transfira o sobrenadante para a mesma garrafa de PETG de 1 L. Descarte os detritos celulares em pellet.NOTA: Purifique imediatamente o sobrenadante clarificado e armazene a 4 °C por até 72 h. Para armazenamento de longo prazo, armazene a -80 °C. Não armazene a -20 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Empilhamento celular com 10 câmaras	Corning	3271
Garrafa de PETG de 1 L	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com D-glucose 1000 mg/L, L-glutamina	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Soro bovino fetal (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Células HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Após o recebimento, descongele as células e cultive conforme descrito no protocolo do fabricante. Uma vez que as células tenham sido subpassadas minimamente e estejam se desenvolvendo bem, congele uma subfração em alíquotas para uso futuro e armazene em nitrogênio líquido. Sempre utilize células com número de passagem inferior a 30. Quando as células cultivadas tiverem sido subpassadas mais de 30 vezes, recomenda-se reiniciar um cultivo a partir das alíquotas armazenadas
Almofada de Suporte para Tubos de Centrífuga de Grande Volume	Corning	CLS431124	A almofada de suporte deve ser usada com tubos de centrífuga de grande volume, a menos que o rotor da centrífuga possua almofadas apropriadas em formato de V
Tubos de Centrífuga de Grande Volume	Corning	CLS431123-6EA	Tubos de centrífuga de 500 mL