Purificação de Vetores de Vírus Adenoassociados Baseada em Cromatografia de Afinidade

Resumo

Fonte: Rghei, A. D., et al. Produção de Vetores de Vírus Associado a Adenovírus em Pilhas de Células para Estudos Pré-clínicos em Modelos de Animais de Grande Porte. J. Vis. Exp. (2021)

O vídeo demonstra a purificação de vetores virais adeno-associados recombinantes (AAV) a partir de lisado bruto de hospedeiro utilizando uma matriz de afinidade baseada em heparina. Partículas virais se ligam à heparina imobilizada, enquanto as impurezas são removidas por lavagem. Um tampão de alta salinidade libera os vírus intactos, que são coletados em frações enriquecidas. Essas frações são concentradas por centrifugação em membrana e lavadas para recuperar partículas residuais, produzindo vetores AAV purificados com alto título.

Protocolo

1. Transfeção dupla com plasmídeos de células HEK293 em empilhamentos celulares

1. Descongele um criovial de células de Rim Embrionário Humano 293 (HEK293) em um banho térmico ajustado a 37 °C.
   OBSERVAÇÃO: Pré-aqueça o meio de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) completo até 37 °C enquanto as células descongelam para prevenir choque térmico durante o plaqueamento. Certifique-se de que as células tenham um número baixo de passagens, idealmente inferior a 20, para garantir crescimento e eficiência de transfeção ideais. Certifique-se de que as células sejam certificadas como livres de micoplasma.
2. Transfira o conteúdo do criovial gota a gota para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de DMEM completo pré-aquecido e centrifugue as células a 500 × g por 5 min.
3. Aspire o meio e, em seguida, ressuspenda as células HEK293 em 20 mL de DMEM completo pré-aquecido. Semee as células em uma placa de 15 cm e incube em 37 °C, com 5% CO₂.
4. Divida as células de uma placa de 15 cm em três para semeadura na câmara de cultura celular.
   1. Quando as células atingirem 80% de confluência, aspire o meio e lave suavemente a placa com 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para não perturbar a monocamada. Em seguida, aspire o PBS e adicione 3 mL de tripsina.
   2. Incubar por 2 min a 37 °C até que as células se soltem da placa, e então neutralize a tripsina adicionando 7 mL de DMEM completo à placa.
   3. Coletar todo o meio e as células em um tubo de 15 mL e fazer a pelagem das células por centrifugação a 500 × g por 5 min.
   4. Aspire o sobrenatante do tubo de 15 mL e re-suspenda o pellet celular em 3 mL de DMEM completo. Adicione 1 mL a cada placa de 15 cm contendo 20 mL de DMEM completo; agite suavemente as placas para distribuir as células uniformemente e incube em 37 °C, com 5% CO₂.
5. Quando as células atingirem 80% de confluência, repita os passos 1.4.1 e 1.4.2. Colete o sobrenadante em tubos cónicos de 50 mL e inverta suavemente o tubo para garantir que as células fiquem homogéneas.
6. Determine a densidade celular misturando 10 µL das amostras de células com 10 µL de azul de tripano e adicionando a mistura a uma lâmina de contagem celular para análise no contador de células.
7. Misture 1 L de DMEM completo pré-aquecido com a suspensão celular necessária para semear a câmara de cultura celular (área superficial de 6360 cm²).²) com 1 × 10⁴ células/cm². Despeje a mistura celular na câmara de cultura celular e gire suavemente para distribuir uniformemente as células por toda a monocamadaFigura 1) e incubar a 37 °C, com 5% CO₂.
8. Além da câmara de cultura celular, plaque uma placa de 15 cm com 1 × 10⁴ células/cm² como referência para a confluência.
9. Após incubação de aproximadamente 65 h, verifique a placa de referência quanto à confluência — idealmente entre 80% e 90%.
   OBSERVAÇÃO: Pré-aqueça o DMEM completo para adicionar à câmara de cultivo celular em 37 °C.
10. Prepare uma mistura de polietilenimina (PEI)/DNA numa razão de concentração de 3:1 (p/p).
    1. Prepare a mistura de DNA em um tubo cônico de 50 mL adicionando 475 µg de pTrangene e 1425 µg de pHelper a 40 mL de meio com soro reduzido para criar uma proporção de 3:1 de pHelper:pTransgene.
       OBSERVAÇÃO: A calculadora da mistura PEI/DNA pode ser encontrada utilizando Tabela 1.

Transfecção da Câmara de Cultivo Celular
Protocolo
1. Deixe o DNA, o OptiMEM e o PEI atingirem a temperatura ambiente antes da transfeção
2. Insira o número de pilhas de células a serem transfectadas (não é necessário excesso)
3. Certifique-se de que as concentrações de DNA estejam corretas, pois isso alterará os volumes necessários
Número de Câmaras de Cultivo Celular		1
Concentração do plasmídeo do transgene		1	mg/mL
Concentração do plasmídeo pDGM6.2FF		1	mg/mL
		Quantidade por câmara de cultivo celular		Mastermix de Transfecção
	OptiMEM	48.1	mL	48.1	mL
Proporção 1:3 pTransgene:pHelper	pTransgene	475	µg	475	µL
	pHelper	1425	µg	1425	µL
4. Adicione os volumes necessários de OptiMEM e DNA plasmidial a um tubo cônico de 50 mL
5. Inverta 10 vezes para homogeneizar
Proporção 3:1 PEI:DNA	PEI Max	5.7	mL	5.7	mL
6. Adicione a quantidade necessária de PEI ao tubo de 50 mL contendo o OptiMEM e o DNA plasmidial
7. Feche imediatamente o tubo de 50 mL e vortexe e inverta 3–5 vezes para misturar.
8. Ajuste um cronômetro para 10 min para incubação dos complexos de PEI
9. Transfira as pilhas de células a serem transfectadas para a Cabine de Segurança Biológica (CSB)
10. Após 10 min, despeje a mistura de transfeção em uma porta laranja.
11. Misture suavemente o líquido por toda a pilha de células
12. Retorne a pilha de células transfectadas ao incubador, garantindo volume igual em cada camada
13. Colete a câmara de cultivo celular 72 h depois

Tabela 1: Calculadora de transfeção para câmara de cultura celular. Planilha interativa para determinar a concentração correta de pTransgene, pHelper e PEI para transfeção da câmara de cultura celular.

2. Adicione 5,7 mL de PEI (1 g/L) ao meio com soro reduzido e à mistura de DNA gota a gota. Em seguida, vortexie brevemente e incube por 10 min a temperatura ambiente.
NOTA: Durante a incubação do PEI/DNA a temperatura ambiente, a solução ficará levemente turva.

11. Após 8 min de incubação com PEI/DNA, remova o meio do compartimento de cultura celular.
    NOTA: Certifique-se de soltar ambas as tampas laranjas para manter um fluxo suave do meio e evitar o desprendimento das células.
12. Adicione PEI/DNA a 1 L de DMEM completo pré-aquecido e despeje lentamente a mistura no orifício do compartimento de cultura celular. Distribua o líquido uniformemente por todas as fileiras (Figura 1) e incube por 72 h a 37 °C, com 5% de CO₂.

2 Colheita do vírus adeno-associado (AAV) e lise química das células HEK293 transfectadas

1. Agite vigorosamente a câmara de cultura celular para desprender as células até que o meio pareça turvo devido às células desprendidas e despeje em quatro tubos de centrífuga de 500 mL.
2. Centrifugue os tubos a 18.000 × g durante 30 min a 4 °C para obter o pellet celular. Despeje o sobrenadante clarificado em uma garrafa de 1 L de copoliéster de tereftalato de polietileno (PETG).
   NOTA: Caso não se tenha acesso a uma centrífuga de alta velocidade, centrifugue a 12.000 × g durante 40 min. O pellet celular pode não ficar sólido nessa velocidade e escorregará ao despejar o sobrenadante.
3. Resuspenda os pellets celulares em tubos de centrífuga de 500 mL com 50 mL de tampão de lise e incube por 60 min a 37 °C.
4. Centrifugue os tubos a 18.000 × g durante 30 min e, em seguida, transfira o sobrenadante para a mesma garrafa de PETG de 1 L. Descarte os detritos celulares em pellet.
   NOTA: Purifique imediatamente o sobrenadante clarificado e armazene a 4 °C por até 72 h. Para armazenamento de longo prazo, armazene a -80 °C. Não armazene a -20 °C.

3 Purificação do vetor AAV utilizando cromatografia de afinidade por heparina

1. Retire o lisado bruto de -80 °C e deixe a 4 °C durante a noite para descongelar. Após o descongelamento, utilize um filtro de 0,22 µM para filtrar o lisado bruto.
2. Para passivar o concentrador centrífugo, adicione 4 mL de tampão de pré-tratamento do filtro a um concentrador centrífugo para cada coluna de heparina sepharose utilizada. Realize a passivação do concentrador centrífugo à temperatura ambiente por 2-8 h. Configure a passivação imediatamente antes das etapas de purificação.
3. Monte a tubulação e a bomba (Figura 2).
   1. Coloque a tubulação em uma bomba peristáltica e passe 20 mL de NaOH 1 M. Em seguida, passe 50 mL de água grau molecular e, depois, 50 mL de DMEM basal.
   2. Conecte a coluna de heparina sepharose de 5 mL à tubulação e passe 25 mL de DMEM basal para remover o conservante.
4. Passe 0,2 µM do lisado bruto filtrado pela coluna a uma taxa de fluxo de 1-2 gotas/s.

NOTA: Certifique-se de não introduzir bolhas nem permitir que a coluna fique seca, pois isso comprometerá a coluna e impedirá a eluição do AAV. Descarte a coluna se ela secar e utilize uma nova coluna para o restante do lisado bruto.

5. Carregue toda a lisado bruto na coluna de heparina e use as seguintes soluções para lavar a coluna.
   1. Lave com 50 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) 1× sem Mg²⁺ e Ca²⁺.
   2. Lave com 15 mL de N-Lauroilsarcosina a 0,5 % em HBSS sem Mg²⁺ e Ca²⁺.
   3. Lave com 50 mL de HBSS sem Mg²⁺ e Ca²⁺.
   4. Lave com 50 mL de HBSS com Mg²⁺ e Ca²⁺
   5. Lave com 50 mL de NaCl 200 mM/HBSS com Mg²⁺ e Ca²⁺.
   6. Elua 5 × 5 mL (25 mL no total) com NaCl 300 mM/HBSS com Mg²⁺ e Ca²⁺ e rotule os eluatos como E1-E5 (cada eluição tem 5 mL).
6. Concentração do vírus utilizando um concentrador centrífugo
   1. Centrifugue o concentrador centrífugo contendo o tampão de pré-tratamento a 900 × g por 2 min. Descarte o fluxo passante.
   2. Lave o filtro do concentrador centrífugo com 4 mL de HBSS com Mg²⁺ e Ca²⁺ e centrifugue a 1000 × g por 2 min; descarte o fluxo passante.
   3. Adicione o eluato E2 ao concentrador centrífugo. Centrifugue a 1000 × g por 5 min e descarte o fluxo passante.
   4. Termine de adicionar E2 e, em seguida, adicione E3 ao concentrador centrífugo e centrifugue a 1000 × g por 5 min até que o vírus concentrado tenha aproximadamente 1 mL.
      NOTA: Evite centrifugar o vetor até que o volume fique abaixo do nível do filtro. Não concentre E1, E4 ou E5 no concentrador centrífugo, pois eles contêm pouca ou nenhuma quantidade de vetor e contêm contaminantes.
   5. Remova o vírus concentrado do concentrador centrífugo usando uma ponteira filtrada p200 e coloque-o em um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL.
   6. Lave o concentrador centrífugo com 200 µL de HBSS com Mg²⁺ e Ca²⁺ para desalojar qualquer AAV remanescente do filtro. Pipete para cima e para baixo vigorosamente várias vezes (por ~30 s) para desalojar qualquer vírus aderido à membrana e coloque no tubo de centrífuga de 1,5 mL com o restante do vírus. Misture bem o tubo.
   7. Aliquote 5 µL para extração de DNA e armazene o vetor purificado a -80 °C.
7. Lave a coluna com 25 mL de NaCl 2 M. Em seguida, use 25 mL de Triton X-100 a 0,1 %, pré-aquecido a 37 °C, para lavar a coluna. Depois, lave a coluna com 50 mL de dH₂O estéril e, em seguida, com 25 mL de etanol a 20%.
8. Assegure-se de que a membrana da coluna esteja completamente saturada com etanol a 20%, pois esta é a solução de armazenamento. Sobreponha tampões fornecidos e armazene a 4 °C.
9. Armazene a tubulação em NaOH 1 M.
   NOTA: Se limpa corretamente, colunas de sefarose de heparina podem ser reutilizadas até cinco vezes.

Resultados

Figura 1: Manuseio da pilha de células para semeadura e transfeção. Para semear a pilha de células, comece removendo uma das tampas de ventilação e despejando 1 L de meio completo de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM), previamente aquecido, com a quantidade necessária de células HEK293 (A). Distribua uniformemente as células e o meio apertando ambas as tampas de ventilação, reúna todo o meio em um canto da pilha de células com uma das tampas e coloque-a nesse canto (B), coloque a pilha de células de lado (C) e, em seguida, gire a pilha de células em 90° (D) de modo que os orifícios de ventilação fiquem para cima (E). Abaixe suavemente a pilha de células até sua posição horizontal normal e certifique-se de que todas as câmaras da pilha de células estejam completamente cobertas pelo meio (F). Ao realizar a transfeção, desparafuse ambas as tampas de ventilação e despeje lentamente o meio antigo em um recipiente estéril para resíduos, com fluxo uniforme para não perturbar a monocamada de células (G).

Figura 2: Configuração da bomba peristáltica para purificação do vírus adeno-associado (AAV). Conduza a tubulação desde o lisado bruto, através da bomba peristáltica, até a coluna com matriz de heparina.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro de 0,22 μm	Millipore Sigma	S2GPU05RE
Tripsina 0,25%	Fisher Scientific	SM2001C
Empilhamento celular com 10 câmaras	Corning	3271
Garrafa de PETG de 1 L	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Placas de cultura celular	Greiner bio-one	7000232	Placas de 15 cm
Tubo cônico para cultura	Thermo Fisher Scientific	339650	Tubo cônico de 15 mL
Tubo cônico para cultura	Fisher Scientific	14955240	Tubo cônico de 50 mL
Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com D-glucose 1000 mg/L, L-glutamina	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Etanol	Greenfield	P016EA95	Diluir álcool etílico (95% vol) para 20% para a seção 3.7.4
Soro bovino fetal (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Soluções salinas balanceadas de Hank (HBSS) com Mg²⁺ e Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
Soluções salinas balanceadas de Hank (HBSS) sem Mg²⁺ e Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH30588.02
Células HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Após o recebimento, descongele as células e cultive conforme descrito no protocolo do fabricante. Uma vez que as células tenham sido subpassadas minimamente e estejam se desenvolvendo bem, congele uma subfração em alíquotas para uso futuro e armazene em nitrogênio líquido. Sempre utilize células com número de passagem inferior a 30. Quando as células cultivadas tiverem sido subpassadas mais de 30 vezes, recomenda-se reiniciar o cultivo a partir das alíquotas armazenadas
Coluna de sulfato de heparina	Cytiva Life Sciences	17040703
Almofada de suporte para tubos de centrífuga de grande volume	Corning	CLS431124	A almofada de suporte deve ser usada com tubos de centrífuga de grande volume, a menos que o rotor da centrífuga possua almofadas apropriadas em formato de V
Tubos de centrífuga de grande volume	Corning	CLS431123-6EA	Tubos de centrífuga de 500 mL
Tubo de microcentrífuga	Fisher Scientific	05-408-129	Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, esterilizar antes do uso
Água grau molecular	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
Sarcosina sódica N-lauroílica	Sigma Aldrich	L5125	ATENÇÃO. Use luvas
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem, meio com soro reduzido	Thermo Fisher Scientific	31985070
Pipetas de Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	Esterilizar antes do uso
Solução salina tamponada com fosfato (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Diluir para 1x para uso em células
Solução de Penicilina-Estreptomicina	Cytiva Life Sciences	SV30010
Plasmídeo pHelper	Projeto de novo ou obtido de repositório de plasmídeos	NA
Bacia para pipetas	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	Adquirir bacias estéreis para pipetas
Éter de polietileno glicol tert-octilfenil (Triton X-100)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	ATENÇÃO. Use luvas
Polietilenimina (PEI)	Polyscience	24765-1	Siga as instruções do fabricante para preparar uma solução de 1 L. Filtrar com filtro de 0,22 μm e armazenar a 4 °C
Plasmídeo pTrangene	Projeto de novo ou obtido de repositório de plasmídeos	NA	Deve conter poliA do SV40 no genoma para ser compatível com a titulação de AAV na seção 5.0
Tubos de bomba	Cole-Parmer	RK-96440-14	Otimizar o comprimento dos tubos e a contenção do vírus nas frações E1-E5
Hidróxido de sódio (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS266-4
Azul de tripano	Bio-Rad	1450021